清胰Ⅱ号对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠Nrf2相关基因水平的影响

柳 源，刘龙中，徐亚沙，谢雪励，李利生，徐尚福，陆远富，吴 芹，石京山

(1. 遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

清胰Ⅱ号对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠Nrf2相关基因水平的影响

柳 源1，刘龙中2，徐亚沙1，谢雪励3，李利生1，徐尚福1，陆远富1，吴 芹1，石京山1

(1. 遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院附属医院 药剂科，贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

目的 研究清胰Ⅱ号对雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎的保护作用及其机制。方法 雄性昆明种小鼠32只，随机分为空白对照组、模型组、清胰Ⅱ号低剂量组(10 g/kg)及清胰Ⅱ号高剂量组(20 g/kg)，每组8只。给药7 d后，采用雨蛙素制模。观察清胰Ⅱ对胰腺指数、血清胰淀粉酶含量、胰腺组织的形态学变化及胰腺组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、醌氧化还原酶(NQO1)、血红素加氧酶(HO-1)、谷胱甘肽合成的限速酶(Gclc)基因的mRNA 水平的影响。结果 与空白组比较，模型组胰腺指数及血清胰淀粉酶水平显著升高(P<0.05)，胰腺组织出现明显水肿及坏死，同时胰腺组织中Nrf2、Nqo1基因的mRNA水平显著增高(P<0.05)。与模型组比较，清胰Ⅱ号给药组胰腺指数及血清中胰淀粉酶水平显著降低(P<0.05)，胰腺组织水肿和坏死明显减轻，胰腺组织中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1、Gclc基因的mRNA水平较模型组显著增高(P<0.05)。结论 清胰Ⅱ号对蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎有预防保护作用，其机制可能与进一步上调胰腺组织中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1、Gclc的水平有关。

清胰Ⅱ号；急性胰腺炎；核因子E2相关因子2；雨蛙素

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是多种病因作用下发生在胰腺组织的急性炎症性病变，发病机制较复杂，大量研究认为其发病机制与胰酶自身消化、白细胞过度激活、氧化应激损伤等有关。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)属于cap-n-collar(CNC)亮氨酸拉链转录激活因子家族，通过诱导一系列抗氧化保护蛋白的编码，提高细胞抗氧化损伤的能力，是机体内一个重要的保护性转录因子[1-2]。近期相关研究表明，通过激活或上调Nrf2信号通路能够有效降低AP实验模型的氧化应激水平，从而达到下调相关炎症因子的水平以及改善其病理状态的目的[3]。清胰Ⅱ号为我院经验方，主要由大黄、虎杖、木香、金钱草等组成，具有利胆、消炎、排石、攻下等功效[4]。本院长期研究证实，清胰Ⅱ号可阻断AP触发的炎症连锁反应，且具有清除氧自由基的功能，对胆汁淤积性肝损伤及急性胰腺炎等具有良好的治疗效果[5-6]。本研究拟采用雨蛙素复制急性胰腺炎小鼠模型，观察清胰Ⅱ号对该模型小鼠胰腺的保护作用及对Nrf2信号通路相关基因的影响，为该药的临床应用提供基础药理学实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品及试剂 清胰Ⅱ号(遵义医学院附属医院提供，大黄40 g，赤芍40 g，芒硝10 g，木香15 g，延胡索15 g，厚朴15 g，牡丹皮15 g，栀子15 g，方剂水煎1次，去渣取汁，4 ℃存储)；RNA提取试剂盒、RNA纯化试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)；引物设计(大连宝生物工程有限公司)；High Capacity Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems, USA)；SYBR®PCR Master Mix (美国BIO-RAD公司)；胰蛋白酶测试盒(南京建成生物工程研究所)；雨蛙素(美国sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 动物 雄性昆明种小鼠32只， SPF级，体重(20±5) g，由重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，许可证号SCXK(军)2012-0011。

1.1.3 仪器 5417R型冷冻离心机(德国eppendorf)；RO.DI-50(H)-RZ型纯水器(Research科技仪器公司)；BS100S型电子分析天平(北京德赛公司)；X-15R型冷冻离心机(美国Beckman)；SIM-F124型制冰机(日本三洋公司)；CFX connect荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD)；ND2000超微量分光光度计(美国Thermo)；Trilogy全自动生化分析仪(美国Drew)；BX43型正置光学显微镜(日本Olympus)；Mastercycler Gradient 梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、给药及制模 将32只昆明种小鼠根据体重进行编号，采用随机数字表法分为4组, 每组8只，即空白对照组、模型组，清胰Ⅱ号低剂量组(简称QYⅡ-L，10 g/kg)、高剂量组(简称QYⅡ-H，20 g/kg)，清胰Ⅱ号低剂量组和高剂量组分别按10和20 g/kg灌胃给药，空白对照组和模型组给予等体积生理盐水，连续灌胃7 d，于末次给药1 h后，除空白对照组外，其余各组腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg)，每1小时注射1次，共6次，制模10 h后再给药1次。于制模12 h后眼眶取血，切取胰腺称其重量，检测胰腺组织相关指标。

1.2.2 小鼠胰腺指数的测定 剖取胰腺，称其重量，按胰腺指数=胰腺重量(g)/体重(g)×100%，计算小鼠胰腺指数。

1.2.3 血清中胰淀粉酶活性检测 小鼠眼眶取血，以3 000 rpm/min 离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书的操作方法，于全自动生化分析仪检测血清中胰淀粉酶活性。

1.2.4 胰腺组织形态学观察 取各小鼠相同部位胰腺组织于4%甲醛溶液中固定48 h，常规石腊包埋、苏木精-伊红染色(Hemaltoxylin and eosin, HE)，使用正置生物显微镜进行观察并拍照。

1.2.5 Real-Time PCR检测Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1、Gclc基因的水平 切取相同部位胰腺组织50～100 mg置于1 mL Trizol中，提取胰腺总RNA，按照试剂盒说明书提取并纯化RNA，采用超微量分光光度计测定其浓度及纯度，A260/A280比值为1.8～2.0表示纯度较理想。从NCBI中查出相关基因序列，由大连宝生物工程有限公司设计合成，见表1。采用两步法逆转录-聚合酶链反应，PCR反应体系为15 μL，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火1 min，40个循环。以β-actin基因为内参照，采用2-△△Ct法计算上述基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

基因基因编号上游引物下游引物β-actinM32599AACTTTGGCATTGTGGAAGGGGATGCAGGGATGATGTTCTNrf2BC026943GAGATATACGCAGGAGAGGTA-AGGCTCGACAATGTTCTCCAGCTTHO-1M33203CCTCACTGGCAGGAAATCATCCCTCGTGGAGACGCTTTACATANQO-1BC004579TATCCTTCCGAGTCATCTCTAG-CATCTGCAGCTTCCAGCTTCTTGKeap1NM_016679AAGGAACATGATATGCCCTGA-CAACACAGGCCGGCTCCATGCLCBC019374TGGCCACTATCTGCCCAATTGTCTGACACGTAGCCTCGGTAA

2 结果

2.1 清胰Ⅱ号对雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰腺指数的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠胰腺指数显著升高(P<0.05)，结果提示小鼠胰腺受损；与模型组比较，清胰Ⅱ号各剂量组的胰腺指数均显著降低(P<0.05，见表2)。

2.2 清胰Ⅱ号对雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰淀粉酶的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠血清中胰淀粉酶含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，清胰Ⅱ号各剂量组小鼠血清胰淀粉酶含量均明显降低(P<0.05，见表2)。

组别给药剂量(g/kg)胰腺指数(%)胰淀粉酶(U/L)空白对照模型QYⅡ-LQYⅡ-H——10.020.00.77±0.091.02±0.12#0.77±0.12*0.82±0.11*534.40±68.63 4503.50±1168.60##2147.91±749.89*1675.41±663.05*

#:P<0.05，与空白对照组比较；##:P<0.01，与空白对照组比较；*:P<0.05，与模型组比较。

2.3 清胰Ⅱ号对雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰腺组织病理学的影响 胰腺组织切片，HE染色，光镜下观察，空白对照组可见胰腺小叶结构完整，胰腺腺泡和胰岛清晰可见，无炎症细胞浸润，无出血和坏死。模型组胰腺组织见不同程度的炎性细胞浸润，导管显著扩张，部分见组织灶状坏死。清胰Ⅱ号治疗组炎性细胞浸润及导管扩张程度减轻，坏死灶明显缩小，未见坏死组织(见图1)。

A：空白对照组；B：模型组；C：清胰Ⅱ号低剂量组；D：清胰Ⅱ号高剂量组。图1 清胰Ⅱ号对雨蛙素所致小鼠急性胰腺炎模型胰腺组织形态学的影响 (HE，×200)

2.4 对小鼠胰腺组织中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1和GclcmRNA水平的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠胰腺组织中Nrf2、Nqo1 mRNA的水平均明增高(P<0.05)；与模型组比较，清胰Ⅱ号给药组小鼠胰腺组织中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1和GclcmRNA水平进一步增高(P<0.05，见图2)。

Control: 空白对照组；Model: 模型组；QYⅡ-L: 清胰Ⅱ号低剂量组；QYⅡ-H: 清胰Ⅱ号高剂量组。#: P<0.05，与空白对照组比较；*: P<0.05，与模型组比较。图2 清胰Ⅱ号对小鼠胰腺组织中Nrf2、Keap1、Nqo1、HO-1和Gclc mRNA水平的影响

3 讨论

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是发生在胰腺组织的急性炎症性病变，病变亦可累及周围器官，许多因素参与其病理生理过程，包括胰酶自身消化激活、炎症介质、大量细胞因子产生，氧化应激损伤等[7-9]。

氧化应激是指活性氧 (ROS) 和活性氮(RNS)过量产生或机体清除能力降低，导致机体氧化还原失衡而发生一系列反应，常伴有一些生物大分子如DNA、蛋白质、脂质等的生理功能损害。最近有研究表明，ROS被认为与AP的发病机制相关。在AP模型中发现ROS水平明显升高，通过进行抗氧化干预，能够在一定程度上缓解AP导致的病理损伤[10-11]。近期的相关研究表明，Nrf2/ARE信号通路在改善AP的病理状态中发挥重要作用[10]。在正常的生理状态下，Nrf2与其分子伴侣Keap1结合于胞浆中，处于功能抑制状态，并由Keap1将其带入泛素化途径进行降解[12-13]。当细胞受到氧化应激或毒素刺激时，Nrf2从Keap1中解离以稳定状态进入细胞核内与抗氧化反应元件(antioxidant responsive element, ARE)相结合，从而上调包括醌氧化还原酶[NAD(P)H: quinone oxidoreductase, Nqo1]，血红素加氧酶(Heme oxygenase-1, HO-1)和谷胱甘肽合成限速酶(Glutamate-cysteine ligase, catalytic, Gclc)在内的一系列抗氧化蛋白的表达，从而降低ROS等氧化应激指标，达到缓解AP的目的[14]。

本实验采用腹腔注射雨蛙素模型制模，通过多次重复腹腔注射，可刺激胰腺过度分泌，进而造成急性胰腺炎损伤。本实验发现，进行腹腔注射雨蛙素后，小鼠胰腺指数及血清胰淀粉酶水平显著升高，胰腺病理表现为组织见不同程度的炎性细胞浸润，导管显著扩张，出现组织灶状坏死，与重症急性胰腺炎有相似的病理特征[15]。提示腹腔注射雨蛙素可造成急性胰腺炎损伤。模型组小鼠胰腺组织见不同程度的炎性细胞浸润，导管显著扩张，部分见组织灶状坏死，清胰Ⅱ治疗组炎性细胞浸润及导管扩张程度减轻，坏死灶明显缩小，未见坏死组织，提示清胰Ⅱ号对急性胰腺炎模型具有预防保护作用。结合近期的研究，为进一步探索清胰Ⅱ号可能机制，继续检测胰腺组织Nrf2相关基因水平。有趣的是，本研究发现，模型组小鼠胰腺组织中Nrf2相关基因的mRNA水平具有升高趋势，可能是由于机体自身的应激状态所导致，结合病理结果提示，小鼠自身氧化应激调节系统对该模型动物胰腺不能够起到有效的保护作用，而清胰Ⅱ号给药组可进一步上调胰腺组织中Nrf2、Keap1，以及相关抗氧化酶Nqo1、HO-1、Gclc基因的mRNA水平，从而可能影响了相关蛋白的表达水平，达到保护该模型小鼠胰腺的目的，我们也将在下一步的试验中进行相关蛋白水平的检测，对mRNA的结果进行验证。

综上所述，本研究发现清胰Ⅱ号对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎有预防保护的作用，其机制可能与进一步激活Nrf2/ARE信号通路从而上调抗氧化酶Nqo1、HO-1和Gclc的水平有关。

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[收稿2016-12-05;修回2017-01-13]

(编辑：王静)

Effects of QingYi Ⅱ on Nrf2 signaling pathway in cerulein-induced acute pancreatitis mice

LiuYuan1,LiuLongzhong2,XuYasha1,XieXueli3,LiLisheng1,XuShangfu1,LuYuanfu1,WuQin1,ShiJingshan1

(1. Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Pharmacy School of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate the protective effects of QingYi Ⅱ on severe acute pancreatitis induced by caerulein in mice, and explore the potential mechanisms.Methods Male KM mice were randomly divided into 4 groups (8 for each): control group, model group, low dose of QingYi Ⅱ group (10 g/kg), and high dose of QingYi Ⅱ group (20 g/kg). Mice were orally administered with QingYi Ⅱ for 7 days, and then intraperitoneally injected with caerulein except the control group. The effects of QingYi Ⅱ were evaluated with the pancreas index, the content of serum amylase, the histomorphology of pancreas, and the gene expressions ofNrf2,Keap1,Nqo1,HO-1 andGclc.Results Compared with the control group, the pancreas index and the concentration of serum amylase of the model group were significantly increased (P<0.05), the pathologic lesion of the pancreas was severe, and the mRNA levels ofNrf2 andNqo1 were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the pancreas index and the content of serum amylase were obviously decreased in the treatment group (P<0.05), the edema and necrosis of pancreas were significantly reduced, and the gene expressions of Nrf2, Keap1, Nqo1, HO-1 and Gclc were significantly increased (P<0.05).Conclusion QingYi Ⅱ can observably protect the pancreas and relieve the severe acute pancreatitis induced by caerulein. The mechanisms might be related to up-regulating the gene expressions ofNrf2,Keap1,Nqo1,HO-1 andGclc.

QingYi Ⅱ; severe acute pancreatitis; nuclear factor E2 related factor 2(Nrf2); caerulein

遵义市汇川科技局项目(NO: E-120)；遵义市红花岗区科学技术项目(NO: 遵红科合社字[2013]09)。

石京山，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail: shijs@zmc.edu.cn；吴芹，女，高级实验师，硕士生导师，研究方向：心血管药理学与神经药理学，E-mail: wuqin@zmc.edu.cn。

R285.5

A

1000-2715(2017)01-0033-05