益生芽孢杆菌脂肽类抑菌成分的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析

李红亚 李术娜 王树香 王 全 李 文 朱宝成

(河北农业大学生命科学学院，保定071000)

益生芽孢杆菌脂肽类抑菌成分的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析

李红亚 李术娜 王树香 王 全 李 文 朱宝成*

(河北农业大学生命科学学院，保定071000)

本文旨在探明一株具有益生潜质的枯草芽孢杆菌N2-10对肠道菌的抗菌作用及其活性成分，为深入评价该菌株的益生功能和益生机理奠定基础。以常见的肠道致病菌和有益菌为指示菌，采用抑菌圈法对该菌株发酵液成分的抑菌活性进行测定，并通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)对其中的活性成分进行分析。结果表明：枯草芽孢杆菌N2-10发酵液的氯仿和正丁醇提取液对供试菌无明显的抑制作用；脂肽类对大肠杆菌、痢疾杆菌和沙门氏菌等肠道致病菌表现出明显的抑菌作用，而对肠道有益菌保加利亚乳杆菌抑制作用很弱，对嗜热链球菌则无抑制作用。脂肽粗提物的HPLC-ESI-MS/MS分析结果显示，脂肽粗提物中的脂肽类抗生素为伊枯草素家族中的C14～C17抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的同系物。因此推断，枯草芽孢杆菌N2-10对肠道致病菌产生抑制作用依赖于其产生的脂肽抗生素Mycosubtilin。

枯草芽孢杆菌；脂肽类物质；抑菌作用；高效液相色谱-电喷雾串联质谱；抗霉枯草菌素

芽孢杆菌作为益生菌的一种重要菌种资源，具有抑制肠道致病菌、调节肠道菌群平衡、防治消化道疾病以及提高机体免疫力等多重作用，在食品、医药及饲料添加剂等领域发挥着重要作用[1-2]。芽孢杆菌在其生长代谢过程中产生的抗菌物质，是其发挥益生作用的重要物质基础[3]。因此明确菌株的抑菌作用及抑菌成分，是研究其益生机理的重要内容。自1945年Johnson等[4]报道枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)产生抑菌物质以来，已从其中分离得到多种抑菌成分，能广泛抑制病原微生物[5-7]。非核糖体合成的脂肽类抗菌物质是其中最常见的一类。此类物质一般是指由1个β-羟基脂肪酸与7～10个氨基酸以酰胺键链接而成的环肽[8]，主要包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)三大家族[9-12]。不同的芽孢杆菌脂肽的抗菌性能有所不同，其中伊枯草菌素主要抑制真菌和部分细菌生长[13]，表面活性素不仅对革兰氏阳性菌、阴性菌和霉菌等多种细菌、真菌有明显抑制作用，还对病毒、支原体和原虫抑制效果显著[14]，丰原素则主要对丝状真菌有强烈的抑制作用[15]。

到目前为止，国内外对芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的抑菌谱及应用研究主要侧重于真菌，尤其是植物病原真菌，其抑菌机理的研究也较为深入[16]，而对其抑制细菌的研究较为缺乏。已报道的对细菌能产生抑制作用的芽孢杆菌脂肽类抗菌物质多限于BacillomycinL(属于伊枯草菌素家族)[17]和表面活性素[18]，而有关于其他的芽孢杆菌脂肽对细菌的抑菌作用则鲜见报道。且在BacillomycinL和表面活性素抑菌谱的研究中主要侧重于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)、变形杆菌(Proteusvulgatis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等致病菌，而忽略了其对有益菌的影响，因此不能客观评价芽孢杆菌对肠道菌群的作用。

菌株N2-10是本课题组从西门塔尔牛新鲜粪便中筛选到的一株枯草芽孢杆菌。该菌株具有很好的益生潜质，能耐受人工胃肠液和胆酸盐，对大肠杆菌有一定的抑制作用，可产生蛋白酶和淀粉酶等消化酶。为深入客观评价其益生功能，本文分别选取肠道致病菌和有益菌为指示菌，测定枯草芽孢杆菌N2-10菌株发酵液成分的抑菌活性；进而通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)对其中的抑菌成分进行分析及鉴定，研究旨在探明枯草芽孢杆菌N2-10菌株的抑菌成分，为该菌株的益生功能和益生机理的研究提供依据。

1 材料与方法

枯草芽孢杆菌N2-10菌株由本课题组分离，保存。

供试致病菌：大肠杆菌(Escherichiacoli)CICC-10004、痢疾杆菌(Shigellaflexneri)CICC21678、沙门氏菌(Salmonellaenterica)CICC21490、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC10306、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CICC20174和保加利亚乳杆菌(Bulgarianlactobacillus)CICC20247由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室保藏。

营养肉汤(NB)培养基(g/L)：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g，用于细菌培养。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10 g、玉米粉13 g、大豆粉13 g。

营养琼脂(NA)培养基(g/L)：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g，琼脂20 g。

1.2 主要仪器

Agilent LC-MSD-Trap-XCT离子阱液质联用仪(Agilent公司，美国)，Agilent C18 reverse-phase column (1.8 μm, 2.1 mm×100 mm)(Agilent公司，美国)，Adventurer电子天平(Ohaus公司，美国)，MLS-3020高压灭菌锅(SANYO公司，日本)，SW-CJ-2FD超净工作台(苏州泰安空气技术有限公司)，GL-21M高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)，旋转蒸发RE-52AA(河南省予华仪器有限公司)，Nanopure超纯水仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)。

在车网协同的基础上，通过车与车、车与路、车与标之间构成一个网络系统来提高交通系统的智能化。多车协同自动驾驶技术是当下智能驾驶的研究热点，也是未来无人驾驶研究的重点技术，该技术的研究可以有效降低交通控制管理的复杂度，同时也能让交通路况更通畅从而减少环境的污染。

1.3 菌株的发酵培养

将N2-10菌株接种于NB培养基中，于37 ℃、180 r/min摇床培养16 h后转接于发酵培养基中，相同培养条件下培养72 h，得发酵液。

1.4 发酵液处理

将200 mL发酵液于4 ℃、5 000 r/min条件下离心10 min，取发酵上清液100 mL依次用3倍体积的氯仿、正丁醇萃取3次，合并萃取液，浓缩。另取发酵上清液100 mL置于灭菌三角瓶中，6 mol/L浓盐酸调pH 2.0后放置过夜。将液体分装于50 mL离心管中，10 000 r/min离心15 min，倾去上清液。向离心管沉淀中加入1.5 mL中性甲醇，混匀、萃取8 h后再离心15 min，弃去沉淀，留上清液。将上清液进行浓缩，获得脂肽类粗提物。利用氮吹仪将氯仿提取物、正丁醇提取物及脂肽类粗提物浓缩至干，分别向其中加入超纯水2 mL，振荡均匀，制成各提取物水溶液。

1.5 体外抑菌活性的测定

采用滤纸片抑菌圈法分别对其进行抑菌活性检测。分别将大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种于NB培养基，置于37 ℃、180 r/min摇床上培养18 h，制得各病原菌的种子液。在超净工作台中，分别吸取4 mL种子液加入到45 ℃左右的100 mL NA培养基中，摇匀后倒平板。待病原菌平板凝固后，分别将吸有各提取物水溶液的灭菌滤纸片(直径8 mm)以合适的间距置于平板上，每组设置3个平行试验。于35 ℃恒温箱培养24 h，观察并记录抑菌圈有无及大小。

1.6 抑菌物质的分析

取1 mL脂肽类甲醇提取液过0.45 μm滤膜，滤液经HPLC-ESI-MS/MS检测。HPLC-ESI-MS/MS系统为Agilent LC-MSD-Trap-XCT离子阱液质联用仪，C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)；等梯度洗脱，洗脱液为0.1%甲酸水溶液∶乙腈=60∶40，流速0.8 mL/min，检测波长230 nm，进样量5 μL；电离方式采用电喷雾，正离子模式；XCT型离子肼质量检测器，检测范围为100～1 700 u。

2 结果与分析

2.1 发酵液成分的抑菌活性

利用痢疾杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌6种供试菌对枯草芽孢杆菌N2-10菌株发酵液不同提取方法所得的提取物进行抑菌测定(图1和表1)。结果表明：氯仿提取物和正丁醇提取物对供试菌的抑制作用较弱或基本无抑制作用，脂肽类粗提物则对致病菌表现出明显的抑制作用，而对有益菌抑制作用较弱或基本无抑制作用。其中氯仿提取物对保加利亚乳杆菌和痢疾杆菌表现出较弱的抑制作用，对其他供试菌基本无抑制作用；正丁醇提取物除去对大肠杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用外，对其他菌没有抑制作用；脂肽类粗提物对供试的肠道致病菌：痢疾杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用明显，对肠道有益菌中保加利亚乳杆菌抑制作用较弱，对嗜热链球菌则无抑制作用。以上结果说明，枯草芽孢杆菌N2-10菌株产生的主要抑菌成分为脂肽类；且脂肽类抗菌物质对肠道致病菌有明显抑制作用，而对有益菌则抑制作用微弱或无抑制作用。

A：大肠杆菌Escherichiacoli；B：沙门氏菌Salmonellaenterica；C：痢疾杆菌Shigellaflexneri；D：金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus；E：嗜热链球菌Streptococcusthermophilus；F：保加利亚乳杆菌Bulgarianlactobacillus；1：脂肽类粗提物 Lipopeptide crude extract；2：氯仿提取物 Chloroform extract；3：正丁醇提取物 n-butanol extract。

图1 不同发酵液提取物的抑菌活性

2.2 抗菌成分的分析及鉴定

采用HPLC-ESI-MS/MS对脂肽粗提物中的抗菌成分进行分析。首先从高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)的一级质谱(ESI-MS)图中获得目标化合物的相对分子质量信息，接着再对各准分子离子进行MS2裂解分析，根据质谱裂解规律推断出化合物的结构。

2.2.1 一级质谱结果

如图2所示，粗提物经HPLC-ESI-MS检测，总离子流(TIC)图中3.6、4.4、6.1和8.4 min对应的4个峰质核比(m/z)分别为1 065.7、1 079.7、1 093.7和1 107.8。以上4个化合物的分子量依次相差14 u，恰好为脂肪酸链长度(—CH2)，与伊枯草菌素家族中的抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的[M+Na]+相符合，因此初步推测4个化合物依次可能为C14～C17Mycosubtilin同系物。

2.2.2 二级质谱(ESI-MS2)结果

对1 065.7、1 079.7、1 093.7和1 107.8对应的[M+H]+进行二级质谱分析，其产生的碎片离子如图3所示。图3中[M+H]+为1 043.8 u的化合物的二级质谱中出现m/z 638.5和801.5的2个碎片离子峰；[M+H]+为1 057.8 u的二级谱中出现m/z 652.6、815.6和928.7的3个碎片离子峰；[M+H]+为1 071.8 u的二级谱图中只出现了m/z 666.5的1个碎片离子峰；而[M+H]+为1 085.8 u的二级谱图中显示比较明显的m/z 680.5和843.5的2个碎片离子峰。以上碎片离子峰中m/z 638.5、652.6、666.5和680.5依次相差14 u，与Mycosubtilin通过CID产生的b型和y型特征碎片离子(图4)中的b5相符；而m/z 801.5、815.6和843.5碎片离子峰则分别与C14Mycosubtilin、C15Mycosubtilin和C17Mycosubtilin产生的b6特征碎片离子相一致；在[M+H]+为1 057.8 u化合物中出现的m/z 928.7则被认定为b7特征碎片离子。

综上可知，枯草芽孢杆菌N2-10菌株所产生的的脂肽类成分为C14Mycosubtilin、C15Mycosubtilin、C16Mycosubtilin和C17Mycosubtilin4个同系物。

A：粗提物的总离子流图；B～E：保留时间分别为3.6、4.4、6.1和8.4 min的峰所对应一级质谱图。

A: total ion chromatogram of crude extract; B to E: ESI-MS chromatogram peaks at retention time of 3.6, 4.4, 6.1 and 8.4 min,respectively.

图2 菌株N2-10发酵液中脂肽类粗提物的HPLC-ESI-MS图

Fig.2 HPLC-ESI-MS chromatogram of the lipopeptide crude extract from strain N2-10 fermentation supernatant

图3 m/z为1 043.8、 1 057.8、 1 071.8和1 085.8的物质的二级质谱图

Pro： 脯氨酸 proline；Ser：丝氨酸 serine；Asn：天冬酰胺 asparagine；β-AA：β-氨基酸；Tyr：酪氨酸 tyrosine；Gln：谷氨酰胺 glutamine。

图4 抗霉枯草菌素通过CID产生的b型和y型离子碎片

Fig.4 Possible b- and y-type fragments produced by CID fromMycosubtilin

3 讨 论

3.1 枯草芽孢杆菌菌株N2-10发酵液成分的抑菌作用

随着耐抗生素菌株的出现以及抗生素残留等问题的日趋严重，寻找安全环保、无耐药性、无残留的抗生素替代品成为当前的研究热点。益生芽孢杆菌及其脂肽抗菌物质具有广谱抗菌活性，不易产生耐药性，是潜在的抗生素理想替代品之一。为深入发掘课题组前期获得的一株具有一定益生作用的枯草芽孢杆菌N2-10菌株的益生潜质，本文以肠道常见致病菌和有益菌为指示菌，测定了菌株发酵液成分的抑菌活性。研究发现，枯草芽孢杆菌N2-10在生长代谢过程中可以产生抑菌物质，其中脂肽类物质的抗菌活性最为明显，并且对供试菌中的大肠杆菌、痢疾杆菌及沙门氏菌等常见肠道致病菌的抑制作用显著，而对有益菌中的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌则基本无抑制作用。此抗菌特点有利于菌株在调节动物肠道平衡，预防致病菌导致的肠道疾病等益生作用的发挥。本研究结果与Fukushima等[19]发现芽孢杆菌可以增加动物胃肠道中乳酸杆菌的数量，并明显降低大肠菌群的数量的结论一致。此研究结果为该菌株益生潜质的深入评价及其抑菌物质的后期研究奠定了基础。

3.2 脂肽类抗菌成分的HPLC-ESI-MS/MS分析

HPLC-ESI-MS/MS是目前用于分析脂肽类化合物分子量及鉴定其结构的有效工具[20]。在本研究中，我们首先从HPLC-MS的一级质谱图发现4个分子量依次相差14 u的分子离子峰1 065.7、1 079.7、1 093.7和1 107.8。通过与已有报道[21]对照，发现其与伊枯草菌素家族中的C14～C17Mycosubtilin同系物的[M+Na]+相符合。继而通过对此4个目标化合物的[M+H]+进行MS2裂解分析发现，4个化合物的二级质谱均有符合C14～C17Mycosubtilin裂解规律的特征碎片离子出现，故而我们断定枯草芽孢杆菌N2-10菌株产生的脂肽类抗菌物质为伊枯草菌素家族中的Mycosubtilin。

4 结 论

本文探明了枯草芽孢杆菌N2-10的脂肽类成分及其对肠道细菌的抗菌谱。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zhu2222@126.com

(责任编辑 武海龙)

Tandem Mass Spectrometry Analysis of Lipopeptides Produced by ProbioticBacillusspp.

High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization

LI Hongya LI Shuna WANG Shuxiang WANG Quan LI Wen ZHU Baocheng*

(CollegeofLifeScience,AgricultureUniversityofHebei,Baoding071000,China)

The aim of this paper was to study the antibacterial effect on the intestinal bacterial and active constituent ofBacillussubtilisN2-10 strain with a latent probiotic capability, to lay the foundation for the healthy function and mechanism of the in-depth evaluation of the probiotic strains. The antibacterial activity of the ingredients from culture broth was detected by the method of inhibition zone in this paper, using pathogens and probiotics commonly colonizing in the intestinal as indicators. The crude extract with antibacterial activity was further detected by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The results of antibacterial assay displayed that the chloroform extract and n-butanol extract the corresponding culture media had not obvious inhibition activity against the tested strains. The crude lipopetide extact exhibited markedly antagonistic activity againstEscherichiacoli,ShigellaflexneriandSalmonellaentericaet cetera intestinal pathogenic bacteria and showed weak inhibitory effect on the probioticBulgarianlactobacillus, but had no effect onStreptococcusthermophilus. HPLC-ESI-MS/MS analysis data revealed that the active components in the crude lipopetide extact were C14 to C17Mycosubtilinhomologus. From all results, it can be concluded thatMycosubtilinis produced and is responsible for the antibacterial activity ofBacillussubtilisstrain N2-10.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1191-1197]

Bacillussubtilis; lipopeptides; antibacterial activity; HPLC-ESI-MS/MS; mycosubtilin

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.014

2016-10-01

河北省科技支撑计划项目(12226605)；河北省高等学校科学技术研究项目(2011232)

李红亚(1977—)，女，河北蠡县人，副教授，博士，主要从事农业微生物学研究。E-mail： lihy77@sina.com

*通信作者:朱宝成，教授，博士生导师，E-mail: zhu2222@126.com

S811.6

A

1006-267X(2017)04-1191-07