栝楼桂枝汤对活化小胶质细胞抗炎作用的研究*

胡海霞 朱晓勤 李钻芳 林如辉 陈立典

（1福建中医药大学中西医结合研究院 福州 350122；2福建中医药大学康复医学院 福州 350122）

●中西药苑●

栝楼桂枝汤对活化小胶质细胞抗炎作用的研究*

胡海霞1朱晓勤1李钻芳1林如辉1陈立典2#

（1福建中医药大学中西医结合研究院 福州 350122；2福建中医药大学康复医学院 福州 350122）

目的：探讨栝楼桂枝汤对活化小胶质细胞抗炎因子的表达水平及上游炎症信号通路的活化情况。方法：先用MTT实验筛选出药物的最佳干预浓度，然后体外LPS刺激制备出小胶质细胞的细胞炎症模型，经栝楼桂枝汤水提液处理后，应用ELISA法、RT-PCR法、Western-blotting法分别检测细胞抗炎因子的表达及相关炎症信号通路蛋白的表达水平。结果：栝楼桂枝汤水提液可显著促进LPS诱导的小胶质细胞中抗炎因子的表达，并上调相应通路蛋白的表达水平。结论：栝楼桂枝汤可通过TRIF信号通路发挥抗神经炎症的作用。

神经炎症；栝楼桂枝汤；小胶质细胞；抗炎

小胶质细胞（M icroglia，MG）是公认的中枢神经系统中主要的固有免疫细胞，约占成年中枢神经系统细胞总量的10%～20%[1]，主要介导中枢神经系统损伤等疾病的免疫反应，在免疫调节过程中发挥核心作用[2]。神经炎症反应的标志就是MG的激活[3]，MG作为CNS固有的免疫效应细胞参与缺血性中风过程中的免疫反应和病理过程[4]。在中枢神经系统中，TLR4主要表达于小胶质细胞，而TLR4所识别的外源性配体主要为LPS。前期实验研究[5]已证实栝楼桂枝汤可以抑制LPS刺激所引起的细胞促炎因子的表达，且可能与炎症通路TLR4/NFkB有关。本实验中，先用MTT实验检测细胞活力后得出最佳刺激浓度，再以LPS干预小胶质细胞在体外制备小胶质细胞炎症模型，然后用栝楼桂枝汤水提液进行干预处理，观察药物对于活化小胶质细胞中抗炎因子的影响作用，并探讨其可能的作用机制。现报告如下：

1 材料

1.1 细胞小鼠源小脑胶质瘤细胞BV2（购自上海复祥生物科技有限公司），源自C57BL/6小鼠小胶质细胞，成纤维样细胞，半贴壁生长。

1.2 药物栝楼桂枝汤组方：栝楼根30 g，桂枝9 g，芍药9 g，甘草6 g，生姜9 g，大枣12枚（药材购自福州国医堂医药公司）。

1.3 试剂高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、青链双抗、PBS缓冲液（美国Hyclone公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），LPS（Escherichia coli 055：B5）、MTT（美国Sigma公司），DEPC处理水（上海基尔顿生物技术公司），Trizol（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），SYBR-GreenⅠ定量PCR试剂盒（日本Takara公司），引物合成（上海生工生物工程公司），ELISA kit IFNβ、IL10（美国R&D公司），大鼠抗TLR3、TRIF（美国Santa Cruz公司），PVDF膜（美国M illipore公司），RAPI细胞裂解液、凝胶配制试剂盒、化学增强发光试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。

1.4 仪器SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰仪器设备有限公司）；ELX808酶标仪（美国BioTek公司）；HF212UV CO2培养箱（香港力康仪器设备有限公司）；电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Bio-Red公司），TS-100F型倒置显微镜（日本Nikon公司）。7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司），垂直电泳槽、转移槽（北京六一仪器厂），凝胶成像分析系统（美国BioRad公司）。

2 方法

2.1 栝楼桂枝汤水提液的制备取栝楼根30 g，桂枝9 g，芍药9 g，甘草6 g，生姜9 g，大枣12枚，浸泡0.5 h，加5倍量的水加热回流2次，1 h/次，过滤，滤液合并，旋转蒸发仪减压浓缩，真空干燥成干浸膏，－20℃冻存备用。

2.2 细胞培养BV2培养于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的高糖DMEM培养基中，置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞呈现80%汇合度后，用0.05%胰蛋白酶消化传代，至对数生长期用于后续实验。

2.3 MTT法筛选栝楼桂枝汤水提液干预浓度和细胞炎症模型制备小胶质细胞株BV2生长至对数期，以5×104个/m l的细胞浓度接种于96孔板，LPS（1 μg/m l）和栝楼桂枝汤水提液（50 μg/m l、100 μg/m l、200 μg/m l）分别干预细胞24 h后，加入MTT（0.5 mg/m l）100 μl继续培养4 h后，再加入培养级DMSO 100 μl溶解甲瓒，振荡后在570 nm处检测各孔吸光度值，观察细胞的生长活力。本研究选用的细胞干预浓度为不影响细胞生长活力的浓度范围。

2.4 ELISA法检测细胞培养上清液中的炎症因子细胞生长至对数增长期后，将细胞以5×105个/m l的细胞浓度接种于24孔板，贴壁过夜后，按如下分组：对照组、LPS（1 μg/m l）干预组、栝楼桂枝汤（50 μg/m l）+LPS组、栝楼桂枝汤（100 μg/m l）+LPS组、栝楼桂枝汤（200 μg/m l）+LPS组，每组各3孔。干预24 h后，收集各组的细胞培养上清，按照TGFβ、IL10的ELISA试剂盒说明书操作，检测培养上清液中抗炎因子的含量。

2.5 Western-blotting实验检测炎症相关蛋白的表达水平细胞以5×105个/m l的细胞浓度接种于细胞培养瓶（规格为25 cm2），用与2.5相同的干预方式干预细胞24 h，干预结束后，提取细胞总蛋白/核蛋白，按每20 mg组织加200～400 μl的比例加入裂解液，冰上放置30 m in，每隔10 m in摇晃1次助融。然后将EP管置于低温离心机中，4℃，12 000 r/m in离心15 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量法测定样本蛋白浓度。进行SDS-PAGE凝胶电泳及转膜，转膜结束后，取出转移膜放入封闭液中，在摇床上常温封闭1 h。用封闭液稀释一抗（抗体稀释度为1∶1 000），封闭结束后将膜浸入配制好的一抗中，置于4℃冰箱过夜。将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液（抗体稀释度为1∶3 000）中，置于摇床上室温反应1 h。用TBST洗膜，增强化学发光法（ECL）显色：置于凝胶成像分析系统进行显色并拍照。实验结果应用Gel Doc凝胶成像系统进行半定量分析。

2.7 统计学分析采用SPSS15.0统计软件（One-way ANOVA）进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 栝楼桂枝汤对小胶质细胞生长活力的影响MTT实验结果表明，栝楼桂枝汤在50 μg/m l、100 μg/m l、200 μg/m l浓度范围内对细胞活力的影响相比较，差异无统计学意义，即对BV2细胞没有毒性。说明栝楼桂枝汤在该浓度范围内可用于后续细胞实验的干预。见图1。

图1 MTT法观察栝楼桂枝汤对小胶质细胞（BV2）生长活力的影响

3.2 栝楼桂枝汤对小胶质细胞炎症介质基因和蛋白表达水平的影响LPS刺激小胶质细胞活化后可释放抗炎因子TGFβ、IL10等，但主要释放哪类因子与细胞的活化状态和时间有关。抗炎因子TGFβ、IL10在LPS刺激细胞后变化不明显，而栝楼桂枝汤可促进抗炎因子的分泌，P＜0.05，与蛋白表达实验结果一致；RT-PCR结果提示，小胶质细胞经LPS活化后TGFβ、IL10等抗炎因子的基因表达量没有显著变化，P＞0.05；栝楼桂枝汤可以促进抗炎因子的基因表达，P＜0.05。见图2～图3。

图2 栝楼桂枝汤对小胶质细胞炎症介质分泌水平的影响

图3 栝楼桂枝汤对小胶质细胞炎症介质基因表达水平的影响

3.3 栝楼桂枝汤对炎症相关通路蛋白表达水平的影响TLR3是唯一启动MyD88非依赖性途径TRIF-IRF3的Toll样受体。LPS干预小胶质细胞BV2后，TLR3和TRIF的基因及蛋白表达水平变化不大，P＞0.05；而栝楼桂枝汤可以浓度依赖性促进TLR3和TRIF基因和蛋白水平的升高，差异有统计学意义，P＜0.05。见图4～图5。

图4 栝楼桂枝汤对小胶质细胞IRF3介导的通路蛋白基因表达的影响

图5 栝楼桂枝汤对小胶质细胞IRF3介导的通路蛋白表达的影响

4 讨论

小胶质细胞在神经炎症调节中发挥着关键的作用。在正常生理状态下，小胶质细胞呈静息状态，当脑缺血损伤发生时，小胶质细胞被活化，但小胶质细胞的过度激活会启动强烈的免疫应答，释放大量炎性因子和细胞毒性物质，引发神经元损伤[6～7]。

在人类中枢神经系统中小胶质细胞可表达TLR1-9[8]，基于募集特异的衔接蛋白，TLRs诱导的信号转导通路主要有MyD88依赖和非MyD88依赖的两个信号转导通路[9]。最近的研究证实，TLRs家族中TLR3发挥着重要的抗炎作用。TLR3特异性募集衔接蛋白TRIF可启动TRIF依赖性途径从而诱导一系列神经保护因子的表达，如IFNβ、TGFβ、IL10、BDNF（Brain Derived Neurotrophic Factor）、神经营养蛋白4（Neurotrophin）、多效生长因子（Pleiotrophin）等，以上这些因子均已证实具有抗炎和/或神经保护作用。研究显示，TGFβ具有很强的抗炎活性，它能降低脑梗死面积和减轻脑水肿，修复脑组织损伤[10]，对兴奋性神经毒素和缺氧所致的神经细胞死亡发挥重要的保护作用[11]。Bsibsi等[12]的研究表明，TLR3激活后还可上调胶质细胞表达抗炎细胞因子IL10，IL10本身可减少MCAO大鼠的脑梗死体积[13]，且与正常小鼠相比，IL10缺乏的小鼠的神经细胞对兴奋性毒性和低糖低氧所致损伤更敏感[14]。TLR3的信号通路则是由衔接蛋白TRIF启动的MyD88非依赖性途径，TRIF被招募至受体启动IKKε磷酸化，最终活化转录因子IRF3、IRF7的活化，转移到细胞核，产生抗炎因子TGFβ等[15]。

本实验首先采用MTT法检测了细胞存活率的变化，通过观察药物对小胶质细胞的毒性作用影响，筛选LPS和栝楼桂枝汤的干预浓度。与对照组相比，LPS和栝楼桂枝汤干预组中细胞存活率未见显著改变，表明LPS在1 μg/m l、栝楼桂枝汤在50～200 μg/m l浓度范围对小胶质细胞无明显毒性影响，即后续实验中选用LPS和栝楼桂枝汤的相应浓度范围干预结果是在不影响小胶质细胞活力的前提下得出的。

实验结果显示，用LPS干预小胶质细胞后，栝楼桂枝汤在抑制TLR4途径活化的情况下[4]，同时激活了TLR3信号途径，TLR3/TRIF/IRF3信号途径可启动抑炎因子的表达，包括TGFβ、IL10等，且与该通路相关的蛋白水平也显著升高，而LPS刺激组中TLR3/TRIF信号通路无明显变化，因此，可以推断，栝楼桂枝汤对小胶质细胞活化的抑制作用是双向调节完成的，即是通过下调TLR4信号和TLR3信号而实现其抑制作用的，维持一定的内环境，即调控小胶质细胞中TLR3通路的活化状态可能是栝楼桂枝汤发挥潜在的神经保护作用的机制之一。

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R743

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.090

2016-12-30）

国家自然科学基金（编号：81403265）

#通讯作者：陈立典，E-mail：cld@fjtcm.edu.cn