大鼠海马兴奋性突触传递的表观受体动力学分析及其应用

郑瑞璇，陶宜楠，石玉含，张环环，汪萌芽

(皖南医学院 细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002)

·基础医学·

大鼠海马兴奋性突触传递的表观受体动力学分析及其应用

郑瑞璇，陶宜楠，石玉含，张环环，汪萌芽

(皖南医学院 细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002)

目的：观察大鼠离体海马脑片CA1区锥体神经元兴奋性突触后电位(EPSP)的刺激强度依赖性及表观受体动力学性质。方法：应用成年大鼠海马脑片CA1区锥体神经元细胞内记录技术，观察不同强度电刺激Schaffer侧支诱发的EPSP的变化，并分析其表观受体动力学特性，以及在LTP中的变化。结果：①电刺激Schaffer侧支诱发EPSP的幅度与刺激强度呈正相关(r=0.9251，P<0.01)，表观解离速率常数K2和表观平衡解离常数KT均随刺激强度增强而降低，对应的相关系数r=-0.9725和-0.9483(P均<0.01)。②给予Schaffer侧支的强直刺激在6个测试神经元中的3个细胞诱发出LTP，对LTP过程中的EPSP表观受体动力学分析显示强直刺激后10 min时K2和KT值减小(P<0.01)。结论：大鼠海马CA1锥体神经元EPSP的表观受体动力学参数具有刺激强度依赖性，表观受体动力学分析方法亦可用于海马LTP的分析。

海马；兴奋性突触后电位；长时程增强；受体动力学

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.02.001

海马是哺乳动物中枢神经系统边缘组织的一部分，它具有多方面的生理功能，被认为是参与学习记忆和情感恐惧记忆等过程的核心脑区[1]，其突触可塑性与学习记忆密切相关[2]，长时程增强(long-term potentiation，LTP) 是N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate，NMDA)受体依赖性突触传递效能的持续性增强，是目前较为公认的中枢神经系统内信息储存的机制[3]。1993年Bliss和Collingridge[4]首次发现海马神经元在受到强直刺激后，会产生LTP现象，在这之后的很多研究都发现LTP与学习和记忆能力之间存在相应的联系。通常观察LTP突触效能变化的指标，主要是兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)的幅度和曲线下面积，也有潜伏期、时程及最大上升斜率等分析的报道[5-7]，而有关递质与受体作用的受体动力学研究却很少，其中海马脑片EPSP及其LTP的受体动力学分析尚未见报道。本实验室前期的研究[7-8]已经证明表观受体动力学分析方法对突触可塑性的研究中进行受体亲和力等性质的分析具有较好的参考价值。因此，本文应用大鼠海马脑片CA1锥体神经元细胞内记录技术，观察刺激Schaffer侧支诱发的EPSP的刺激强度依赖性和表观受体动力学性质，并对其在LTP受体动力学分析中的应用进行了初步的探讨，为进一步分析海马兴奋性突触传递及其LTP的受体动力学机制提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 海马脑片的制备 取成年雄性Sprague Dawley大鼠(体质量150～200 g)，购自南京青龙山动物繁殖场。按文献报道方法[9]，吸入乙醚全身麻醉后断头，在头部正中剪开皮肤，咬去颅骨，剪开软脑膜并取出全脑，置于0～4℃、用95%O2+5%CO2混合气体饱和的人工脑脊液(ACSF)中矢状对切，将一侧脑的海马取出，放于与水平成45°角V形槽的琼脂块中，用胶水(Super Glue)固定在振荡切片机(Vibratome，Technical Products International Inc，USA)的浴碟内，随后立即加入ACSF冰水混合物并持续通氧，用固定在振荡切片机上的刀片(Gillete)横向切取400～500 μm的切片若干，置于室温(20～25℃)下的经混合气体饱和的ACSF中备用。整个切片过程限制在15 min。

1.2 细胞电生理记录 海马脑片在室温下孵育0.5～1 h后，取一脑片置于全浸式记录浴槽(容积0.5～1.0 mL)的底网上，上方使用盖网固定。通过恒流泵以3 mL/min左右速率持续灌流混合气体饱和的ACSF，并控制浴槽温度保持在室温25℃左右。用P-97程控拉制仪(Sutter Instrument Co，USA)，把玻管毛坯拉成实验所需的微电极，电极内充入少许3 mol/L乙酸钾，电极尖端的阻抗以80～140 MΩ为宜，固定于微操纵仪上，将探头(headstage)上的银丝插入电极尾端，调整显微操作装置，对海马脑片CA1锥体神经元进行细胞穿刺。当电极尖端缓慢碰到细胞膜时，利用微电极放大器的遥控开关(Buzz)给予2 ms的瞬时振荡，让微电极的尖端刺入细胞内。记录到的电信号经由Axoclamp 900A微电极放大器、DigiData 1440A联机采样接口、pClamp 10.2软件(Axon Instrument/Molecular Devices，USA)用计算机进行采样、记录和贮存。三通道电子刺激器(NIHON KOHDEN，Japan)输出的脉冲经放大器由微电极向细胞内注射，而Schaffer通路电刺激则经SS-201J隔离器(NIHON KOHDEN，Japan)后由置于Schaffer侧支通路所在处的同芯双极电极进行局部刺激。

1.3 电刺激方法 在Schaffer侧支施加测试刺激(单脉冲，波宽0.1 ms，10次/分钟，10～100 V)，在CA1区锥体神经元细胞内记录EPSP反应，记录到稳定15 min的EPSPs后，进行强直刺激(100 Hz，50脉冲/串，波宽0.4～1.0 ms，共6串，串间隔10 s，电压强度等同于测试刺激)，之后继续记录测试刺激诱发的EPSPs至少30 min。

1.5 受体动力学分析方法 按报道方法[7-8,10]，EPSP上升相和下降相的直线化公式分别为In[Veq/(Veq-V)]=(K1·S+K2)·t和In(V/Veq)=-K2·t，直线回归后可得斜率为K1S+K2和-K2，由此算出表观结合速率常数K1、表观解离速率常数K2，以及表观平衡解离常数KT(表征平衡解离常数KD)：KT=K2/K1，即表观半幅有效递质浓度(表征EC50)，KT值越小，亲和力越强。

2 结果

2.1 海马CA1神经元EPSP的刺激强度依赖性 对在CA1区记录到的神经元，在Schaffer侧支加以不同强度(单脉冲，波宽0.1 ms，10次/分钟，10～100 V)的电刺激，图1例示一个神经元记录到的EPSP呈刺激强度依赖性结果，由此分析记录到的大鼠海马脑片CA1锥体神经元EPSP的各个参数与刺激强度的相关性，直线相关分析结果显示，在1 T～1.5 T范围内，EPSP的幅度与刺激强度呈显著正相关(r=0.9251，P<0.01，图2A)。

T：阈强度；箭头(Sch)：对Schaffer侧支电刺激的刺激伪迹;该神经元的静息电位为-70 mV。

图1 大鼠海马脑片CA1锥体神经元EPSP的刺激强度依赖性

2.2 海马CA1神经元EPSP的表观受体动力学性质 以阈强度T为单位，对12个具有刺激强度依赖性的海马脑片CA1锥体神经元EPSPs的各项表观受体动力学参数进行分析，可见在1 T～1.5 T范围内，表观受体动力学参数K1值与刺激强度不存在明显的相关性；K2值和KT值均随刺激强度增大而逐渐减小，呈负相关，相应r=-0.9725和-0.9483(P均<0.01，图2B～D)。

2.3 海马CA1神经元EPSP的LTP现象 通过在Schaffer侧支施加测试刺激，记录到至少稳定15 min的EPSPs后，施加强直刺激。在测试的6个神经元中，有3个细胞在强直刺激前后神经元的基本电生理参数保持稳定，且强直刺激后EPSP幅度或曲线下面积增大到基础值的120%以上并持续30 min以上，可鉴定为LTP现象。在这3个细胞进行强直刺激前5 min和后10 min处各取两个点进行曲线下面积的配对t检验，结果显示，P<0.01，说明强直刺激后EPSP的曲线下面积显著增大(表1)。

表1 强直刺激前后大鼠海马脑片CA1锥体神经元EPSP参数的变化

2.4 LTP过程中的EPSP表观受体动力学分析 如上所述，在产生LTP现象的3个细胞进行强直刺激前5 min和后10 min处各取两个点，对其LTP过程中的EPSP表观受体动力学参数进行配对t检验分析，结果表明，EPSP的K1值变化不大(P>0.05)，而K2和KT值在强直刺激后均显著减小(P<0.01，表1)。

3 讨论

本实验观察到，大鼠海马脑片CA1区锥体神经元EPSP在1 T～1.5 T范围内的表观受体动力学参数呈刺激强度依赖性，即表观解离速率常数K2和表观平衡解离常数KT均与刺激强度呈负相关。因KT提示了受体亲和力的变化，故海马脑片CA1区锥体神经元EPSP的表观受体动力学分析，可能在观察LTP的受体动力学机制中具有参考价值。

已有报道显示，在人的海马中，谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质，通过激活谷氨酸受体参与多种功能的调节。谷氨酸受体分为离子型和代谢型两类，离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptors,iGluRs)又包括NMDA受体与非NMDA受体(AMPA受体、KA受体)，而NMDA受体在学习记忆、突触可塑性、神经发育等方面都具有重要的作用[11]。功能性NMDA受体通道的激活，对Ca2+、K+、Na+通透性增强，可产生兴奋性突触后电位。就本实验而言，EPSP的幅度等参数与刺激强度呈正相关，说明具有刺激强度依赖性。而刺激强度依赖性的表观受体动力学分析结果显示，K2值与刺激强度呈负相关，提示随着刺激强度增大且EPSP增大的过程中，递质与突触后相应受体的解离速率减慢；KT值也随刺激强度增大而降低，提示在刺激强度增大时，递质与突触后受体作用的亲和力升高，突触后可能不断有受体被激活，特别是高亲和力的NMDA受体的激活，但不排除还存在其他更复杂的受体参与介导的可能性。

给予强直刺激后，在测试的6个神经元中，有3个细胞EPSP幅度或曲线下面积增大到基础值的120%以上，且维持超过30 min，根据LTP的判断标准[12-13]，可以被判定诱发了LTP。在海马发育早期，NMDA受体参与了LTP的建立[14]。给予一定强度和频率的电刺激后，谷氨酸能突触的后膜去极化，Ca2+浓度升高，激活钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，磷酸化的CaMKⅡ和NMDA受体的NR2B亚单位亲和力增高，通过某种机制移除阻碍Ca2+内流的Mg2+，从而使NMDA受体通道复合体的通道开放，Ca2+内流，并触发神经元内一系列的生化反应，进而改变突触后膜的性质，诱发LTP[14-16]。本实验的表观受体动力学分析表明，强直刺激后10 min EPSP的K1值未明显变化，而K2值和KT值则明显减小(P<0.01)，这与我们实验室前期关于脊髓运动神经元LTP的表观受体动力学分析结果相类似，提示递质与突触后受体的亲和力增大，可能与大量高亲和力的NMDA受体被激活有关[7]，说明EPSP的表观受体动力学分析方法可能也适用于海马CA1锥体神经元的LTP分析，而海马CA1锥体神经元EPSP的LTP受体动力学特性还需要进一步的研究和探讨。

综上所述，通过对离体大鼠海马脑片CA1区锥体神经元EPSP的刺激强度依赖性和表观受体动力学性质的分析，表明EPSP的表观受体动力学参数具有刺激强度依赖性特征，而其LTP过程也涉及K2值和KT值的减小过程，可能也为海马CA1神经元突触可塑性分析提供了一个新的有参考价值的方法。

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Analysis of the apparent receptor kinetics in excitatory synaptic transmission in rathippocampus

ZHENG Ruixuan,TAO Yi′nan,SHI Yuhan,ZHANG Huanhuan,WANG Mengya

Cell Electrophysiology Laboratory,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To observe the stimulus intensity-dependent and the apparent receptor kinetics properties of excitatory postsynaptic potential (EPSP) in hippocampal CA1 pyramidal neurons in the slice preparation of adult rats byinvitrotechnique.Methods:Hippocampal CA1 neurons were prepared from the slices of adult rats,and intracellular recording technique was used to observe the changes of EPSPs evoked by Schaffer collateral electrical stimulation at different intensities,and the receptor kinetics properties of EPSPs and the changes of receptor kinetics in long-term potentiation(LTP) were analyzed with apparent receptor kinetics technique.Results:①The amplitude of EPSPs evoked by Schaffer collateral stimulation was increased with higher stimulus intensity (r=0.9251,P< 0.01),while the correlation coefficient (r) between apparent dissociation rate constant (K2) or apparent equilibrium dissociation constant (KT) of EPSPs and stimulus intensity was decreased,with corresponding correlation coefficient of -0.9725 or -0.9483(P<0.01);②The LTP was evoked by tetanic stimulation of Schaffer collaterals in 3 of the 6 tested neurons,and the apparent receptor kinetics of EPSPs during LTP showed decreasedK2andKTat 10 min following tetanic stimulation(P<0.01).Conclusion:The apparent receptor kinetics parametersK2andKTof EPSPs in hippocampal CA1 pyramidal neurons are stimulus intensity-dependent,and the apparent receptor kinetics analysis may be used for measurement of LTP in hippocampus either.

hippocampus;excitatory postsynaptic potential;long-term potentiation;receptor kinetics

1002-0217(2017)02-0103-04

国家自然科学基金项目(31271155)；皖南医学院大学生科研资助项目(WK2015S20)

2016-10-18

郑瑞璇(1992-)，女，2014级硕士研究生，(电话)13024042877，(电子信箱)13024042877@163.com； 汪萌芽，男，教授，博士，硕士生导师，(电子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通信作者。

R 338

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