不同预处理方法对玉米秸秆酶解性能的影响

田庆文，房桂干,3*，沈葵忠,3，刘雯雯，梁龙

(1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，国家林业局林产化学工程重点开放性实验室，南京210042； 2.南京林业大学林业资源高效加工利用协同创新中心，南京210037； 3.中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京100091)

不同预处理方法对玉米秸秆酶解性能的影响

田庆文1,2，房桂干1,2,3*，沈葵忠1,2,3，刘雯雯1,2，梁龙1,2

(1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，国家林业局林产化学工程重点开放性实验室，南京210042； 2.南京林业大学林业资源高效加工利用协同创新中心，南京210037； 3.中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京100091)

研究了NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3等4种化学联合盘磨预处理方法对玉米秸秆酶解性能的影响，考察了不同预处理方法对物料得率、木质素脱除率、还原糖得率、聚糖转化率和结晶度的影响。结果表明，预处理后，玉米秸秆的结晶度均降低。机械盘磨可以减小纤维长度和颗粒尺寸，增大比表面积，暴露出更多的纤维素活性位点，增加纤维素和纤维素酶的反应活性，提高其酶解性能。确定了酶解适宜的条件：纤维素酶用量30 U/g，β-葡萄糖苷酶用量10 U/g，酶解温度50℃和时间72 h，在此条件下NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3联合盘磨预处理后玉米秸秆的还原糖得率分别为41.00%，23.02%，65.77%和22.22%，聚糖转化率分别为39.04%，18.53%，70.49%和21.33% 。在最优条件下，NH3·H2O联合盘磨预处理玉米秸秆的还原糖得率和聚糖转化率最高，是一种具有前景的预处理方法。

预处理；玉米秸秆；酶解；还原糖得率；聚糖转化率

当今社会，人类面临严峻的环境污染、能源匮乏和资源短缺等问题。越来越多的国家积极探索新能源，来替代日益枯竭的化石燃料等能源[1-2]。木质纤维素生物质资源储量丰富，通过适当预处理方法转化为低聚糖或可发酵糖，制备燃料乙醇或平台化学品等高附加值产品，可以减少人类对化石资源的依赖，减轻对环境的污染破坏[3-6]。在我国，玉米秸秆作为一类可再生资料，含量丰富，来源广泛且价格低廉，因此将其转变成高附加值的糖类和相关化学品十分必要[7]。然而，玉米秸秆中纤维素结晶度比较高，且木质素和半纤维素填充在纤维和细微纤维之间，使得纤维素和纤维素酶的接触困难，从而导致酶解效果较差[7-9]。因此，需要对木质纤维素类原料进行预处理。

目前，提高木质纤维类原料酶解效果的预处理方法有稀酸预处理、碱预处理法、氢氧化钙预处理、氨浸渍预处理和SPORL法等[10-13]。碱预处理法能够有效降低木质纤维素生物质的木质素含量，提高碳水化合物酶水解的速率和得率[14]。石灰法预处理条件不如NaOH和氨激烈，但具有操作简单、成本低的优点，使其成为一种有吸引力的预处理方法[15]。氨浸渍法(SAA)是为了解决ARP工艺中半纤维素损失问题，将半纤维素以固体形式保留，可以进行同步发酵，避免了将含量较少的低聚糖单独转化为期望产品的难题[16]。SPORL方法是一种在酸性条件用少量亚硫酸盐化学品联合盘磨机械处理方法，可以克服木材中木质素对酶解的抗逆性，实现针叶木的高效生物转化[17]。

本研究采用NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO34种化学联合盘磨方法预处理玉米秸秆，在相同的反应条件下比较4种化学方法对玉米秸秆的物料得率和木质素的脱除率的差异；此外，通过优化反应因素(温度、时间和纤维素酶用量)对NaOH预处理后玉米秸秆酶解还原糖得率的影响，考察4种不同预处理方法对还原糖得率、酶解还原糖得率、聚糖转化率及结晶度的影响，以期为木质纤维素类物料的预处理工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

玉米秸秆来自山东，运至南京实验室。5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、苯酚、葡萄糖等药品购于国药集团化学试剂公司，均为分析纯。纤维素酶(Celluclast 1.5 L, Novozymes公司)和纤维二糖酶(Novozyme 188，Novozymes公司)。

MSD挤压破碎机(Andritz-Sprout-Bauer公司)；蒸煮锅(西北轻工业学院机械厂)；紫外分光光度计(UV-3100，Shimadzu公司)；X射线衍射仪(D8，Bruker)。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理与保存

运输至实验室的玉米秸秆，洗净后直接进行MSD挤压切碎，然后装于黑色塑料袋中，放于冷库保存。玉米秸秆的组分如表1所示。

表1 玉米秸秆的主要成分

1.2.2 测定方法

1)NaOH预处理玉米秸秆

称取1 200 g上述绝干玉米秸秆，将其放置在15 L的蒸煮罐中，并加入一定量的NaOH溶液和水，保持固液比为1∶4(m/V)，其中NaOH的用量为10%。将蒸煮罐放入蒸煮锅中进行加热，130℃保温60 min。反应结束后将预处理后的玉米秸秆多次洗涤、甩干后搅散装入聚氯乙烯塑料袋密封，0～5℃冷藏保存备用。

2)氨水、氢氧化钙和NaHSO3预处理玉米秸秆

氨水、氢氧化钙、NaHSO3方法预处理玉米秸秆的实验过程和步骤与上述NaOH预处理方法基本一致。其中，氨水、氢氧化钙、H2SO4和NaHSO3用量分别为10%，10%，2%和8%。

经上述NaOH、氨水、氢氧化钙和NaHSO3(2% H2SO4/8% NaHSO3)法预处理的玉米秸秆原料分别进行盘磨处理，其中，进料速度为800 r/min，盘磨间隙0.6～2.0 mm。盘磨处理后的物料分别置于聚氯乙烯塑料袋密封，分别命名为AP、SAP、LP和SPORL，0～5℃冷藏保存备用。

3)纤维素酶解

玉米秸秆纤维素酶解实验方法参照Huo等[18]。其中，还原糖得率计算方法为：

式中：YR为还原糖得率，%；M1为预处理后物料绝干质量，g；V为水解液总体积，L；n为测定还原糖浓度时稀释的倍数；C为还原糖质量浓度，g/L。

聚糖转化率计算方法为：

式中：YC为聚糖转化率，%；y为预处理后物料得率，%；YR为还原糖得率，%；YT为还原糖的理论得率，%(针对纤维素水解得到葡萄糖时YT=111.1%，针对戊糖水解得到木糖时YT=113.6%，YT根据试料中葡萄糖和木糖的比例进行取值)；yc为原料中的聚糖含量，%，本研究中玉米秸秆聚糖含量为原料中纤维素含量和戊糖含量，为59.89%。

1.3 分析方法

1.3.1 木质素的脱除率

原料和预处理后物料的酸不溶木质素、酸溶木质素和糖组分分析按照NREL方法进行分析[19-20]。木质素脱除率计算方法为：

式中：RL为预处理木质素脱除率，%；L1为原料中总木质素的含量，%；L2为预处理后物料总木质素含量(基于原料计算)，%。

1.3.2 结晶度分析

玉米秸秆原料和预处理后物料真空干燥后，研磨125～180 μm，采用X射线衍射仪测定物料衍射强度，结晶度计算公式为[21]：

式中：ICr为结晶度指数，%；I002为002晶面的最大衍射强度，2θ=22°附近的极大峰值；Iam为非结晶背景衍射的散射强度，2θ=18°附近的峰谷值。

2 结果与分析

2.1 4种预处理方法对木质素脱除率和物料得率的影响

预处理后玉米秸秆质量减少，主要是因为玉米秸秆在预处理过程中损失了部分溶解性物质，这些溶解性物质主要包括木质素、半纤维素和其他可溶性物质。从表2可以看出，4种化学处理条件较为温和，只有部分木质素和半纤维素溶出，4种预处理方法的得率均较高[10,22]。不同预处理方法物料的木质素溶出程度存在较大差异，NaHSO3和NaOH预处理方法在木质素脱除方面具有明显的优势，而Ca(OH)2预处理后的玉米秸秆木质素脱除率非常低。

表2 4种预处理方法对木质素脱除率和物料得率的影响

注：表中木质素含量为基于原料计算所得。

2.2 反应因素对NaOH预处理玉米秸秆酶解还原糖得率的影响

2.2.1 纤维素酶用量对玉米秸秆还原糖得率的影响

纤维素酶用量直接影响玉米秸秆酶解性能。实验中采用NaOH预处理后的玉米秸秆，探究了纤维素酶用量对还原糖得率的影响，结果如图1所示。实验条件为：固液比1∶40(m/V)，酶解温度50℃，时间24 h，纤维二糖酶用量10 U/g(即1 g绝干物料需10 U的纤维二糖酶，U为纤维二糖酶活力单位，在1 min内将1 μmol纤维素二糖转化为2 μmol葡萄糖所用的酶量为一个β-葡萄糖苷酶活力单位)。

图1 纤维素酶用量对NaOH预处理玉米秸秆酶解还原糖得率的影响Fig. 1 Effect of enzyme loading on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by NaOH

由图1可知，随着纤维素酶用量的增加，还原糖得率也随之逐渐增加，且还原糖得率比较低。当纤维素酶用量低于30 U/g(即1 g绝干物料需30 U纤维素酶，U为纤维素酶活力单位,1 mL液体酶在50℃，指定酸性纤维素酶pH为4.8条件下，每小时由滤纸底物生成1 μmol葡萄糖所用的酶量为一个纤维素酶活力单位)时，随着酶用量的增加，还原糖得率迅速增加；当酶用量高于30 U/g时，随着酶用量的增加，还原糖得率稍有增加。这可能是由于酶解过程中，纤维素酶分子首先吸附到纤维素表面，反应生成还原糖，在固液比一定的情况下，底物中可酶解部分含量会逐渐减少，还原糖得率会逐渐接近某一极限值。因此当底物浓度一定时，纤维素酶充分吸附到纤维素表面，继续增加纤维素酶量时，还原糖的酶解转化率不能显著提高。

2.2.2 酶解时间对玉米秸秆还原糖得率的影响

试验探究了反应时间对于NaOH预处理玉米秸秆酶解还原糖得率的影响，结果如图2所示。其中反应条件为：固液比1∶40(m/V)，酶解温度50℃，纤维素酶用量为30 U/g和纤维二糖酶用量10 U/g。由图2可以看出，随着反应时间增加，还原糖得率呈上升趋势且不断增大。在反应时间较短的初始阶段，还原糖得率增加较为明显，随着时间的延长(≥72 h)，还原糖得率上升趋势逐渐减小并趋于平稳。这可能是因为在反应刚开始时，纤维素酶与底物接触吸附较为充分，反应速率较快，随着反应的进行，无定形区纤维素基本水解完成。因此，纤维素酶的水解反应控制在72 h左右比较合适。

图2 反应时间对NaOH预处理玉米秸秆酶解还原糖得率的影响Fig. 2 Effect of reaction time on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by NaOH

2.2.3 酶解温度对玉米秸秆还原糖得率的影响

纤维素酶作为一种特殊的蛋白质，其理化性质和生物活性与温度密切相关。图3为温度对NaOH预处理玉米秸秆酶解还原糖得率的影响，其中实验条件：固液比1∶40(m/V)，时间72 h，纤维素酶用量30 U/g和纤维二糖酶用量10 U/g。由图3可知，当温度低于50℃还原糖得率增加，之后随着温度的升高还原糖得率又开始下降。这主要是由于温度变化会影响纤维素酶的活性，温度升高可以激活纤维素酶的活性，但是温度继续升高时，蛋白质发生变性，从而使得纤维素酶失去活性。因此，50℃是纤维素酶活性的最佳温度，此时玉米秸秆的酶解效果较好。

图3 温度对NaOH预处理玉米秸秆酶解还原糖得率的影响Fig. 3 Effect of reaction temperature on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by NaOH

2.3 不同预处理方法及盘磨前后对酶解还原糖得率的影响

图4 不同方法预处理玉米秸秆盘磨前后对酶解还原糖得率的影响Fig. 4 Effect of before and after refining on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by different pretreatment methods

为了进一步探究不同预处理方法对玉米秸秆酶解性能的影响，分别对不同预处理方法及盘磨前后的玉米秸秆进行了酶解实验，其还原糖得率如图4所示，其中实验条件为：固液比1∶40(m/V)，时间72 h，温度50℃，纤维素酶用量30 U/g，纤维二糖酶用量10 U/g。由图4可知，不同预处理方法物料的木质素溶出程度存在较大差异，还原糖得率也存在较大差异。从表2可知，虽然NaOH法与NaHSO3法木质素溶出程度接近，但两者还原糖得率存在较大差异，说明木质素溶出量并不是影响物料酶解效率的唯一因素，还可能与其他因素有关，例如细胞壁中木质素的溶出位置有关[23]。4种化学预处理中，NH3·H2O预处理的物料中木质素溶出量不大，比NaOH法和NaHSO3法低30%以上，但在相同酶水解条件下，还原糖得率高达54.13%，比NaOH预处理方法高31.91%，这可能与氨水预处理的特殊作用有关，氨水可以实现一定的木质素溶出效果。氨水对木质纤维素生物质的渗透和润胀作用较强，水解时纤维素酶能够更好地与纤维素接触[24-25]。

此外，4种方法预处理后的玉米秸秆经盘磨后还原糖得率均高于盘磨前的玉米秸秆。NaOH联合盘磨后的玉米秸秆的还原糖得率为41.00%，相比于盘磨前提高了17.78%；Ca(OH)2预处理后的玉米秸秆经盘磨后，其还原糖得率从16.87%升高至23.02%；盘磨后NH3·H2O处理的玉米秸秆还原糖得率提高了11.64%；SPORL处理后的玉米秸秆，还原糖得率为22.22%，提高了4.04%。这主要是由于玉米秸秆经盘磨后，其纤维长度和颗粒尺寸均减小，比表面积增大，暴露出更多的纤维素活性位点，从而有利于纤维素酶充分吸附到纤维素表面，使得还原糖含量增高[26]。

2.4 不同预处理方法对聚糖转化率的影响

4种化学联合盘磨预处理方法对玉米秸秆聚糖转化率的影响如图5所示。聚糖转化率是从物料得率和还原糖得率两个指标来综合评价预处理的效果。从图5可以看出物料经盘磨后，NH3·H2O盘磨预处理的物料聚糖转化率最高，为70.49%；NaOH预处理的聚糖转化率为39.04%；SPORL预处理的聚糖转化率为21.33%，Ca(OH)2盘磨预处理的聚糖转化率最低，为18.53%。综合比较这4种预处理方法可以看出，NH3·H2O联合盘磨预处理法是一种有前景的预处理方法。

2.5 不同预处理方法对结晶度的影响

木质纤维原料的结晶度反映的是结晶纤维素所占的比例，通常被认为是影响酶解的重要原因。本试验采用X射线衍射法探究了原料和4种不同化学联合盘磨预处理方法对于玉米秸秆结晶度的影响，其结果如图6和表3所示。玉米秸秆预处理前后XRD和结晶指数分析结果表明，玉米秸秆预处理前后结晶度指数均减小，但纤维素的晶型没有变化，这主要是由于木质素和半纤维素溶出较少，在润胀和盘磨作用下，结晶度指数下降。预处理后结晶指数减小，说明在化学预处理联合盘磨过程中原料的结晶结构得到了破坏。纤维在碱性条件下得到了充分的润胀，体积膨大，然后在盘磨机的挤压和碾磨作用下细胞结构进一步被破坏，因而结晶结构也会得到一定程度的破坏[27]。

图6 原料与化学联合盘磨预处理后物料的X射线衍射图Fig. 6 The XRD patterns of raw and pretreated materials

预处理种类预处理方法结晶度指数/%原料-3140化学+盘磨NaOH+盘磨(AP)2423Ca(OH)2+盘磨(LP)1248NH3·H2O+盘磨(SAP)1870NaHSO3+盘磨(SPORL)2022

3 结 论

1)玉米秸秆采用4种温和的化学预处理(NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3)物料得率均较高，得率范围为64%～74%，NaOH和NaHSO3预处理法木质素的脱除率比较高。

2)NaOH预处理玉米秸秆酶解效果最佳条件为：纤维素酶用量30 U/g，β-葡萄糖苷酶用量10 U/g，酶解温度50℃和时间72 h。在此条件下，NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3联合磨盘预处理后的玉米秸秆酶解的还原糖得率分别为41.00%，23.02%，65.77%和22.22%。

3)预处理的玉米秸秆经过机械盘磨后可以降低纤维尺寸，增加纤维素酶和纤维素的接触面积，从而提高还原糖得率，且预处理后物料的结晶度降低。NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3预处理玉米秸秆经盘磨后，还原糖得率提高了17.78%，6.15%，11.64%和4.04%，聚糖转化率分别为39.04%，18.53%，70.49%和21.33%。

4)氨水预处理后的玉米秸秆，酶解效果最佳，物料得率、还原糖得率和聚糖转化率都比较高，分别为72.12%，65.77%和70.49%。NH3·H2O预处理法是一种有前景的预处理方法，对于木质纤维素类资源的有效利用具有重要的作用。

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Effect of different pretreatments on the enzymolysis propertiesof corn stalk

TIAN Qingwen1,2, FANG Guigan1,2,3*, SHEN Kuizhong1,2,3, LIU Wenwen1,2, LIANG Long1,2

(1. Institute of Chemical Industry of Forestry Products,CAF, National Engineering Lab. for Biomass Chemical Utilization, Key Lab. of Forest Chemical Engineering,SFA, Key Lab. of Biomass Energy and Material, Nanjing 210042, China; 2. Collaborative Innovation Center for High Efficient Processing and Utilization of Forestry Resources, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 3. Institute of New Technology of Forestry, CAF, Beijing 100091, China)

The effects of different chemical pretreatment methods with NaOH, Ca(OH)2, NH3·H2O and NaHSO3associated with mechanical refining on the enzymatic hydrolysis of corn stalk were evaluated. The solid yield, delignification rate, reducing sugars yield, polysaccharide conversion and crystallinity of the corn stalk resulted from the four aforementioned pretreatment methods were compared. The crystallinity of the corn stalk decreased after the four pretreatments, indicating that the crystal structure of the raw materials was damaged to a certain extent during the chemical pretreatment combined with the grinding process. The length of the fibers and size of the corn stalk particles all decreased while the specific surface area increased after the mechanical disk grinding. More active sites of the cellulose were exposed after the pretreatment, resulting in more adequate contact between cellulose and cellulase, and therefore enhancing the efficiency of the enzymatic process. The optimum enzymatic performance of cellulose was obtained at 50℃ for 72 h with the cellulase and glucosidase doses of 30 U/g and 10 U/g, respectively. Under the optimal condition, the reducing sugars yields of corn stalk from pretreatment by NaOH, Ca(OH)2, NH3·H2O and NaHSO3associated with mechanical refining were 41.00%, 23.02%, 65.77% and 22.22%, and the polysaccharide conversions were 39.04%, 18.53%,70.49% and 21.33%, respectively. Furthermore, the reducing sugars yield of corn stalk also increased after mechanical refining. Corn stalk pretreated by NH3·H2O with mechanical refiner gave the highest reducing sugar yield and polysaccharide conversion.

pretreatment; corn stalk; enzymolysis; reducing sugars yield; polysaccharide conversion

2016-08-09

2016-10-11

“十二五”国家科技支撑计划课题(2014BAD02B02)。

田庆文，男，实习研究员，研究方向为生物质预处理技术及环境保护技术。通信作者：房桂干，男，研究员。E-mail: fangguigan@icifp.cn

TQ401

A

2096-1359(2017)02-0089-06