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IFN-α通过IFI16抑制人脑血管外膜成纤维细胞增殖并促进细胞凋亡①

2017-04-24龙向淑田茂波

中国免疫学杂志 2017年4期
关键词:外膜纤维细胞细胞周期

黄 晶 宋 方 龙向淑 田茂波 吴 强

(贵州省人民医院心内科,贵阳550002)

IFN-α通过IFI16抑制人脑血管外膜成纤维细胞增殖并促进细胞凋亡①

黄 晶 宋 方 龙向淑 田茂波 吴 强

(贵州省人民医院心内科,贵阳550002)

目的:探讨干扰素-α(IFN-α)是否通过诱导干扰素诱导蛋白16(IFI16)表达抑制人脑血管外膜成纤维细胞(HBVAFs)增殖与促进细胞凋亡。方法:应用转染针对IFI16基因的小干扰RNA(siRNA)和/或IFN-α瞬时干预体外培养的HBVAFs。通过蛋白免疫印迹(Western blot)法和Real-time PCR法测定细胞中IFI16、P53、P21蛋白和mRNA表达水平的变化。用MTT法检测细胞活力,流式细胞术测定细胞周期及凋亡。结果:与未干预组比较,IFN-α(2 000~5 000 kU/L)干预HBVAFs后,IFI16蛋白表达水平明显上调,但不同浓度IFN-α组之间无统计学差异。使用2 000 kU/L IFN-α可诱导HBVAFs中P53及P21蛋白和mRNA表达水平上调,同时抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。但在转染了IFI16 siRNA的HBVAFs中IFN-α的上述作用受到了抑制。结论:IFN-α抑制HBVAFs增殖与促进其凋亡的作用可能部分与其诱导IFI16表达有关。

干扰素诱导蛋白;干扰素-α;血管外膜成纤维细胞;增殖;凋亡

作为动脉管壁外膜最重要的细胞成分血管外膜成纤维细胞(Vascular adventital fibroblasts,VAFs),其增殖、参与血管内膜和中膜的形成、分泌胞外基质及迁移等作用,参与了血管增殖性疾病(如高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉搭桥术后及支架植入术后再狭窄等)主要的病理生理过程[1-3]。干扰素(Interferon,IFN)通过表达多种IFN诱导蛋白发挥抑制增殖、促进凋亡、干预细胞分化等作用[4]。前期研究发现IFN-α能抑制VAFs及血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的增殖,促进VAFs凋亡[5-7];IFN-β不但能抑制细胞增殖还能抑制动脉粥样硬化的进程[8]。干扰素诱导蛋白16(Interferon-inducible protein 16,IFI16)是IFN诱导蛋白p200家族的人源蛋白成员之一,研究发现IFI16参与了细胞增殖、凋亡的调控[9]。前期研究发现IFN-α可通过诱导该蛋白家族成员p204(该蛋白结构与IFI16相似)表达抑制大鼠主动脉外膜VAFs增殖,促进大鼠血管平滑肌细胞凋亡[10,11]。但IFN-α对VAFs增殖与凋亡的影响是否与其诱导IFI16表达有关尚未见文献报道。本研究拟观察IFN-α对VAFs增殖与凋亡的影响及IFI16表达变化,为研究IFN及其诱导蛋白运用于防治血管增殖性疾病提供更多理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑血管外膜成纤维细胞(Human brain vascular adventitial fibroblasts,HBVAFs)细胞株(ScienCell公司)。DMEM高糖培养基和胎牛血清(HyClone公司)。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)。噻唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、细胞周期与凋亡检测试剂盒(碧云天公司)。Real-time PCR荧光染料试剂(TaKaRa公司)。人β-actin引物上游:TGGCACCACACCTTCTACAATG,下游:TCATCTTCTCGCGGTT-GGC;人IFI16引物上游:GAAGTGCCAGCGTAAC-TCCTA,下游:TACCTCAAACACCCCATTCAC;人p53引物上游:CTCCTCAGCATCTTATCCGAG,下游:GCTGTTCCGTCCCAGTAGATTA,人p21引物上游ATGTGGACCTGTCACTGTCTTG,下游ATTAGGGCT-CCTCTTGGAGAA(上海生工生物公司)。逆转录试剂(Fermentas公司)。P53抗体、P21抗体(EPITOMICS公司)。IFI16 siRNA(h)、Control siRN-A-A、siRNA transfection medium、siRNA transfection reagent、IFI16抗体、β-actin抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 HBVAFs的培养 从液氮罐中取出HBVAFs细胞冻存管经37℃水浴,再经10倍体积DEME培养液(含10%胎牛血清)漂洗。1 000 r/min离心5 min后弃上清液,加入1 ml上述培养液吹打重悬细胞,加培养液至4 ml后,置于37℃含5%CO2培养箱内。24 h后更换新培养液。采用复苏后第3代生长状态良好的细胞用于实验。

1.2.2 分组 实验分为7组,正常培养为Negative组;用终浓度2 000~5 000 kU/L IFN-α分别干预24 h 后,即获2 000、3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α组。在Negative组中转染质控siRNA和针对IFI16基因的siRNA 48 h后,用2 000 kU/L IFN-α处理24 h 后分别为Control siRNA组和IFI16 siRNA组。每实验组均设3个复孔,实验重复 3 次。

1.2.3 Real-time PCR检测mRNA表达 按Trizol法提取总RNA后,42℃ 60 min,70℃ 5 min合成cDNA。Real-time PCR采用95℃ 30 s预变性,95℃ 5 s,60℃ 34 s,重复循环40次。95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s进行熔解曲线。计算各组IFI16、P53、P21 mRNA的相对表达量。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 通过细胞裂解液(RIPA)提取细胞蛋白。蛋白定量后加入SDS-PAGE上样缓冲液,沸水5 min变性。湿法转膜转移蛋白条带至NC膜。常温下5%脱脂奶粉封闭1 h;TBST洗膜;加入一抗工作液4℃过夜孵育(IFI16抗体稀释度1∶500;P53、P21抗体稀释度1∶1 000;β-actin抗体稀释度1∶5 000);TBST洗膜;37℃孵育二抗1 h;TBST洗膜;ECL化学发光;X光胶片显影、定影后对胶片进行扫描。BandScan 4.3软件计算IFI16、P53、P21与β-actin吸光度比值。

1.2.5 MTT 检测细胞增殖活力 收集对数增殖期细胞,按细胞数4×103个/孔接种于96孔板,各组细胞继续培养48 h后按噻唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书测定细胞增殖活性。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 按细胞周期与凋亡检测试剂盒说明书测定DNA含量分析与凋亡。

2 结果

2.1 干预后对IFI16、P53和P21表达的影响 与Negative组比较,2 000、3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α组中IFI16蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05);与2 000 kU/L,3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α组间IFI16蛋白及mRNA表达无统计学意义。与2 000 kU/L IFN-α组比较,IFI16 siRNA组中IFI16、P53、P21蛋白及mRNA表达水平下降(P<0.05)。2 000 kU/L IFN-α组与Control siRNA组间差异无统计学意义(图1、2)。

图1 干预后IFI16蛋白和mRNA水平在HBVAFs中的表达情况Fig.1 Effect of intervention factors on expression of IFI16 protein and mRNA in HBVAFsNote:1.Negative;2.2 000 kU/L IFN-α;3.3 000 kU/L IFN-α;4.4 000 kU/L IFN-α;5.5 000 kU/L IFN-α.*.P<0.05 vs negative.

图2 干预后IFI16、P53、P21蛋白和mRNA水平在HBVAFs中的表达情况Fig.2 Effect of intervention factors on the expression of IFI16,P53,P21 protein and mRNA in HBVAFsNote:*.P<0.05 vs negative;#.P<0.05 vs 2 000 kU/L IFN-α.

图3 干预后对HBVAFs细胞增殖与凋亡影响Fig.3 Effect of intervention factors on cell proliferation and apoptosis of HBVAFsNote:*.P<0.05 vs negative,#.P<0.05 vs 2 000 kU/L IFN-α.

2.2 IFN-α对细胞增殖、凋亡的影响 与Negative组比较,2 000 kU/L IFN-α组MTT吸光度A值减低(P<0.05),G0/G1期细胞与凋亡细胞数增多,S期细胞数减少 (P<0.05)。与2 000 kU/L IFN-α组比较,IFI16 siRNA组MTT吸光度A值增加(P<0.05),G0/G1期细胞与凋亡细胞数减少,S期细胞数增多 (P<0.05)。2 000 kU/L IFN-α组与Control siRNA组间差异无统计学意义(图3)。

3 讨论

血管壁内、中、外膜主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞与VAFs组成。长期以来均将前两者视为血管增殖性疾病病理改变的关键作用靶点,VAFs仅作为“旁观者”起着营养与支持的作用[1]。然而随着研究的深入,发现在血管损伤后血管重构过程中,VAFs增殖活性、合成细胞外基质以及转化为肌成纤维细胞能力明显增强[12,13]。因此VAFs在血管增殖性疾病的发生、发展过程并非旁观者而是像“哨兵”一样起着关键的作用[3],故促进VAFs增殖及其凋亡是防治上述疾病的措施之一。

IFN分为Ⅰ型(IFN-α、β、τ等)、Ⅱ型(IFN-γ)与Ⅲ型(IFN-λ),是一组具有多种生物学效应(如抗增殖、调节免疫应答、抗病毒等)的活性细胞因子家族。体外实验证实IFN-α能抑制血管壁细胞增殖[5-7]。动物实验发现动脉球囊损伤后通过在损伤局部转染过表达IFN-β或肠外给予IFN-γ能抑制新生内膜的形成与血管平滑肌细胞增殖[14,15],提示在血管增殖性疾病的治疗过程中运用IFN是可行的。本研究结果也同样显示IFN-α能抑制HBVAFs增殖与促进其凋亡。

IFI16蛋白作为IFN诱导蛋白p200家族成员在上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞、部分肿瘤细胞等胞核与胞质中存在表达[16,17],并能被IFN-α、β、γ等诱导表达[17]。IFI16蛋白氨基端有参与蛋白与蛋白相互作用的PYD构域与核定位序列(Nuclear localization sequences,NLS),二者通过与凋亡、炎性反应信号通路相关蛋白之间的相互结合参与细胞增殖、凋亡、分化及炎症反应调控等过程[16]。本研究通过Westem blot表明,IFI16蛋白在HBVAFs中存在基础表达,并且IFN-α干预HBVAFs 24h后能诱导IFI16蛋白表达,但在2 000~5 000 kU/L浓度范围内诱导IFI16表达未呈现剂量依赖性。因此推测在HBVAFs中IFI16可能是发挥IFN-α多种生物学功能的重要下游蛋白之一。抑癌基因p53能够通过下游基因p21抑制细胞周期进程促进细胞凋亡与老化[18]。有研究发现,IFI16蛋白通过p53、p21通路抑制脐静脉内皮细胞增殖,但在感染人乳头状瘤病毒而永生化的HUVEC 中,由于致癌基因E6和E7抑制p53的活性,导致IFI16抑制增殖的作用受到明显限制[19]。亦有研究发现,在人胚胎肾细胞293中转染IFI16基因后,IFI16蛋白200A结构域中的MFHATVATIF基序与p53羟基端结合,增加p53的表达,从而抑制细胞增殖[20]。而在乳腺癌细胞中上调IFI16蛋白表达能通过活化p53的bax启动子激活p53的表达,并增加其下游目的基因p21表达,从而激活p53介导的细胞凋亡与增殖抑制[21]。大量的研究说明IFI16在调控细胞增殖与凋亡过程中与p53/p21等细胞周期调控蛋白存在密切关系。本研究结果显示,在2 000 kU/L IFN-α干预HBVAFs后更多的细胞停滞在G0/G1期,凋亡细胞数亦有所增加。IFN-α在诱导IFI16表达增加的同时P53与P21的表达也上调了。然后沉默IFI16基因后IFN-α诱导的上述作用受到了限制。无论诱导IFI16过表达还是抑制IFI16表达,P53与P21蛋白及mRNA表达水平均与其呈一致性变化趋势,这表明IFI16在抑制VAFs增殖与促进凋亡过程中可能与诱导P53和P21表达有关。提示IFN-α抑制HBVAFs增殖,促进其凋亡过程中,P53/P21可能作为IFI16的下游蛋白而发挥其作用。

综上所述,IFN-α能促进IFI16、P53、P21表达,抑制VAFs增殖,诱导其凋亡,推测IFI16可能参与了IFN-α对VAFs增殖、凋亡的调控,P53/P21途径可能参与该生物学效应的下游调控。从而为IFN及其诱导蛋白应用于血管增殖性疾病提供更多的理论依据。

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[收稿2016-05-16 修回2016-06-24]

(编辑 许四平)

Interferon alpha suppresses proliferation and induces apoptosis of human brain vascular adventitial fibroblasts via IFI16

HUANGJing,SONGFang,LONGXiang-Shu,TIANMao-Bo,WUQiang.

DepartmentofCardiology,GuiyangProvincePeople′sHospital,Guiyang550002,China

Objective:To study interferon alpha (IFN-α) inhibition of proliferation and apoptosis induction of human brain vascular adventitial fibroblasts(HBVAFs)via IFI16.Methods:Cultured HBVAFs were treated with transfection IFI16 siRNA and/or IFN-α in vitro instantaneously.The protein and mRNA levels of IFI16,P53,P21 were measured by Western blot and Real-time PCR.MTT was used to detect the cell proliferation of the HBVAFs.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.Results:IFN-α with terminal concentration of 2 000-5 000 kU/L induce significantly expression of IFI16 in HBVAFs,without any significant difference.Stimulated with 2 000 kU/L IFN-α up-regulated the expression of P53,P21 at protein and mRNA levels,and inhibited the cell proliferation and promote cells apoptosis in HBVAFs.Such effect was restrained by transfection with IFI16 siRNA into HBVAFs.Conclusion:IFN-α inhibits HBVAFs proliferation and induces apoptosis may partly relate to the increased IFI16 expression.

Interferon-inducible protein;IFN-α;Vascular adventitial fibroblasts;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.003

①本文为国家自然科学基金项目(No. 81260030)。

黄 晶(1988年-),男,硕士,主治医师,主要从事冠心病基础与临床方面的研究,E-mail:herenwushui@sohu.com。

及指导教师:吴 强(1969年-),男,博士,主任医师,主要从事冠心病基础与临床方面的研究,E-mail:gzgywq@126.com。

R363

A

1000-484X(2017)04-0494-04

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