黄精多糖的提取及其免疫活性研究

卜红南

药学

黄精多糖的提取及其免疫活性研究

卜红南

目的研究黄精多糖的提取工艺及其免疫活性。方法以料液比、粉碎粒度、提取时间为考察因素，以多糖的得率作为指标，响应面优化黄精多糖的提取工艺；并通过建立免疫抑制小鼠模型，对该组分多糖的免疫调节作用进行研究。结果影响黄精多糖提取的主要因素为粉碎粒度，最佳提取工艺为：料液比1∶20，提取时间2 h，粒度为0.6 cm2，黄精多糖得率为11.142%。免疫结果显示，黄精多糖能显著提高小鼠的脾脏指数、巨噬细胞吞噬指数。结论该工艺切实可行，可为黄精多糖的利用提供参考。

黄精多糖；响应面优化法；免疫活性

黄精为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygouatum）植物多花黄精、滇黄精、卷叶黄精等的干燥根茎。归脾、肺、肾经。具有补气养阴、健脾润肺、益肾等功效［1，2］，对于抗炎症，抗肿瘤等的发生有很好的作用［3-5］。《日华子本草》中提到黄精“补五劳七伤，助筋骨，生肌，耐寒暑，益脾胃，润心肺。”

目前国内外研究黄精多糖的提取分离方法包括热水提取、醇析分离、微波辅助提取、超声波提取等［6-8］，但耗能高、提取率较低。本研究采用水提醇沉法，以黄精多糖的得率为考察指标，通过响应面优化黄精多糖的提取工艺，并通过免疫抑制小鼠模型，对该组分多糖的免疫调节作用进行研究，结果提取工艺的优化能够提高黄精多糖的得率，且黄精多糖能提高小鼠的免疫功能，对黄精临床用药起到指导性作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料及仪器黄精（河北省安国市华仁药材有限公司，由山东中医药大学韩春超教授鉴定为黄精属植物卷叶黄精的干燥根茎）；无水葡萄糖对照品（HPLC≥98%）（中国食品药品检定研究院）；浓硫酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；苯酚（天津市科密欧化学试剂有限公司）；瑞氏染色液（青岛海博生物技术有限公司）；生理盐水；试剂均为分析纯；水为蒸馏水。紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；分析天平（千分之一，上海天平仪器厂）；分析天平（万分之一，上海菁海仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHB-B95型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；高速离心机（上海医疗器械集团有限公司手术器械厂）。

1.1.2 实验动物及细胞小鼠，5~10周龄，每只（25±5）g，雌雄各半，由山东中医药大学动物中心提供。鸡红细胞悬液；由山东中医药大学免疫学教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 黄精多糖提取工艺的研究（1）黄精多糖的提取及供试品溶液的制备。在单因素实验的基础上，响应面优化黄精多糖的提取工艺，按照最佳提取工艺：称取黄精药材，粉碎，筛取粒度为0.5 cm2的药材粉末，加入15倍量水，回流提取3次，1.5 h/次，滤液浓缩至相当于原药材的1 g，用乙醇使含醇量达到50%进行醇沉，冷藏过夜，取上清液，3000 r/ min离心10min弃去沉淀，减压浓缩后加入3倍体积的无水乙醇，沉淀即为黄精多糖，40℃烘干保存，称取一定量的黄精多糖蒸馏水定容至0.572 g/m l，作为黄精多糖供试液。（2）苯酚-硫酸法测定黄精多糖含量。称取10mg的无水葡萄糖，蒸馏水定容至100m l，分别精密移取100μg/m l的葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml置于10m l具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0 ml，加入1.0m l 5%的苯酚溶液混匀，再加入5.0ml 98%的浓硫酸，混合均匀，室温下显色20min，以蒸馏水为空白，在490 nm波长处测定吸光度（A）。以吸光度A（Y）为纵坐标，葡萄糖的浓度（X）为横坐标进行回归处理得标准曲线。（3）单因素试验方法。称取等量的黄精原材料100g，分别研究不同的料液比、提取时间、粒度对黄精多糖提取率的影响，从这4个方面设计单因素试验。料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h；粉碎粒度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 cm2。用苯酚-硫酸比色法测定黄精多糖的含量。（4）黄精多糖提取工艺参数的优化。在单因素试验的基础上选用料液比、提取时间、粉碎粒度4个因素，采用响应面优化黄精多糖提取的工艺条件。实验因素水平选择如表1所示。

表1 实验因素水平及编码

1.2.2 黄精多糖免疫活性的研究（1）鸡红细胞悬液制备。抽取新鲜的鸡血于烧杯中，慢慢倒入离心管中，加入生理盐水摇匀，以1000 rpm，离心20min，反复洗涤3次，配制成3%的鸡红细胞悬液制备，4℃下保存备用。（2）黄精多糖供试品溶液对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响。取小鼠24只，随机分成4组，每组6只，雌雄各半，以步骤1.2.1中配制的黄精多糖供试液为药物，随机分为对照组、低剂量中药组（5 g/kg·d）、中剂量中药组（10 g/kg·d）和高剂量中药组（15 g/kg·d），各剂量组小鼠通过灌胃的方式给药，早晚各一次，持续20 d，对照组灌以同剂量的蒸馏水。各小鼠正常进食，第19天分别腹腔注射新鲜淀粉牛肉汤1ml/只，轻柔腹部48 h后，腹腔注射3%鸡红细胞生理盐水悬浮液1m l/只，30min后处死，取腹腔炎性渗出液抹片，瑞氏染色，镜检。计算吞噬百分率和吞噬指数［6］。吞噬百分率=具有吞噬活性的吞噬细胞/100个吞噬细胞。吞噬指数=具有吞噬活性的吞噬细胞吞噬鸡红细胞数/100个吞噬细胞中具有吞噬活性的吞噬细胞。（3）黄精多糖供试品溶液对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响。另取小鼠24只，随机分成4组，每组6只，雌雄各半，随机分为对照组、低剂量中药组（5 g/kg·d）、中剂量中药组（10 g/kg·d）和高剂量中药组（15 g/kg·d），各剂量组小鼠通过灌胃的方式给药，早晚各一次，给药20 d，给药结束后，脱臼处死，称重法［7］测定小鼠的脾脏指数，使用电子天平称量小鼠体质量及脾脏（剔除器官的结蹄组织与脂肪组织）的重量，计算得出结果（胸腺指数=胸腺质量/小鼠体质量）。

2 结果

2.1 根据所述方法绘制标准曲线以吸光度Y为纵坐标，葡萄糖的浓度X为横坐标进行回归处理，得回归方程为Y=7.1405X+0.1959，R2=0.9993结果表明葡萄糖在5.0~50μg/m l范围内具有良好的线性关系。

2.2 黄精多糖的提取工艺的优化

2.2.1 料液比对黄精多糖提取率的影响分别选用料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，粉碎粒度为0.6 cm2，提取时间1 h，提取2次的条件下对黄精多糖进行提取。结果表明，随着料液比的增加黄精多糖提取率也逐渐升高，当料液比为1∶15时提取率最高，随后提取率有所下降，见图1。

图1 料液比对黄精多糖提取影响

2.2.2 提取时间对黄精多糖提取率的影响分别选用提取时间0.5、1、1.5、2、2.5，料液比为1∶15，粉碎粒度为0.6 cm2，提取次数为2次的条件下对黄精多糖进行提取。结果表明提取时间为1.5 h时提取率最高，随后有所下降，见图2。

图2 提取时间对黄精多糖提取率的影响

2.2.3 粉碎粒度对黄精多糖提取率的影响分别选用粉碎粒度为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 cm2，料液比为1∶15，提取时间1.5 h，提取2次的条件下对黄精多糖进行提取。结果表明粉碎粒度为0.5 cm2时黄精多糖的提取率最高，根据单因素工艺考察得到黄精多糖的最佳提取工艺是黄精粉碎粒度为0.5 cm2，料液比为1∶15，提取时间为1.5 h。见图3。

图3 粉碎粒度对黄精多糖提取率的影响

2.2.4 响应面优化黄精多糖提取工艺响应面优化法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合［6-12］，本文采用Design-Expert（version8.0.5）对表2试验数据进行多项式拟合回归，建立了各因素与黄精多糖提取率之间的二次响应面回归模型Y=-219.4100+ 123.88750X1-0.17980X2-0.90550X3-0.05000X1X2+ 1.10000X1X3+0.19100X2X3－120.10000X12+1.66000E-003X22-0.38400X32，其各因素的方差分析结果见表3。回归方程中各因素与响应值黄精多糖得率影响的显著性，由F检验来进行判定，并且概率的值越小，则其相应变量的显著性就越高。

由表3可知，模型的P<0.0001，失拟项P>0.01，表明该模型二次方程拟合显著。表明所建立的回归二次模型成立，从回归模型系数显著性检验结果可知：X1、X2、X3、X12对滴丸成型率影响极显著。

响应曲面的分析图是特定的响应值对相应自变量所构成的一个三维空间图，由此可以直观的反应各因素变量对响应值的影响。在实验考察中，各因素变量对黄精多糖提取率影响的、二维等高线和三维响应曲面图见图4～图6。图4为粉碎粒度和料液比对多糖提取率影响的二维等高线、三维响应曲面，由此图可见，随着料液比的变大多糖提取率升高，但粉碎粒度比例增大，出现先升高后下降的趋势，考虑是粉碎过细导致药材过滤出现不同程度损失。图5为提取时间和粉碎粒度对多糖得率影响的二维等高线、三维响应曲面，由此图可见随着提取时间增长多糖增大。图6料液比和提取时间对多糖得率影响的二维等高线、三维响应曲面，由图可见，料液比和提取时间对多糖得率都呈现正相关。

表2 响应面分析法Box-Behnken组合设计试验及结果

表3 黄精多糖提取率的方差分析结果

图4 粉碎粒度和料液比对多糖提取率影响的二维等高线、三维响应曲面

图5 提取时间和粉碎粒度对多糖得率影响的二维等高线、三维响应曲面

图6 料液比和提取时间对多糖得率影响的二维等高线、三维响应曲面

2.2.5 模型验证优化后黄精多糖的提取工艺为：料液比1∶20，提取时间2 h，粒度为0.6 cm2，在该条件下黄精多糖提取率为11.142%，为了验证模型的真实性，称取150 g黄精药材3份，粉碎，过筛，按照优化后的提取工艺料液比1∶20，提取时间2 h，粒度为0.6 cm2进行实验，黄精多糖得率分别为11.09%、11.30%、11.28%。优化工艺模型成立。

2.2.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果

根据实验方法和计算公式，得出各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。结果如表4所示，黄精多糖供试品各剂量均可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，并呈现剂量依赖关系，说明黄精多糖能显著增强免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

表4 各组小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数（n=6）

2.2.7 黄精供试品对小鼠胸腺、脾脏指数的影响结果根据实验方法和计算结果得出，小鼠胸腺指数和脾脏指数随着黄精供试品的剂量增大而增大，并呈现剂量依赖的关系。见表5。

表5 小鼠胸腺、脾脏指数的影响结果（n=6）

3 结论

目前水提法已经成为提取黄精多糖的主要方法，根据中药成分在水和乙醇中的溶解性不同，去除蛋白质、糊化淀粉、脂溶性色素等杂质［14，15］，本文使用50%醇进行醇沉，即保证不会由于醇浓度过高导致有效成分被包裹而造成损失，又可以充分去除淀粉等杂质，起到纯化多糖的作用，其工艺成本低，损耗小，适用于工业化大生产。

相较于陈钢等［16］关于响应面优化黄精多糖提取工艺，本文考察因素更为具体，分析各因素结果及其之间的交互作用，并确定了影响黄精多糖提取的最大影响因素是粒度；相较于傅圣斌［17］关于黄精多糖的研究，本文的提取工艺耗能低，操作简单，适合于工业大生产，且提取的黄精多糖免疫活性较强。本实验采用Design-Expert（version8.0.5）优化黄精多糖得率的考察，在单因素实验基础上确定了3个因素对黄精多糖提取的优化条件为：料液比1∶20，提取时间2 h，粒度为0.5 cm2，在该条件下黄精多糖提取率为11.142%，但是目前考察因素较少，仍需进一步考察，比如提取温度、提取次数等因素，本文研究仅仅是在微沸的状态下提取3次进行其他因素的考察，后续研究仍在继续。

多糖是黄精最主要的有效成分，免疫活性是多糖最主要和最重要的生物活性。本文通过鸡红细胞试验和小鼠胸腺指数、脾脏指数试验综合考察黄精多糖免疫活性，结果表明黄精多糖具有明显的免疫增强作用，且药效与剂量存在相关性。为黄精进一步开发提供了科学依据。

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［17］傅圣斌，钱建鸿，陈乐意，等.黄精多糖的提取及其对小鼠免疫活性的影响［J］.中国食品学报，2013，1（1）：68-72.

［2016－07－16收稿，2016－08－14修回］［本文编辑：刘一洋］

Study on the extraction process and immune activity of polygonatum polysaccharide

BU Hong-nan.
Department of Gynecology and Obstetrics，No.89 Hospital of PLA，Weifang，Shandong 261021，China

Objective To study the process of extracting polygonatum polysaccharides（PSP）and its immune activity.M ethods On the basis of prelim inary experiment，independent variables included solid-liquid ratio，grinding particle size，extraction time，the yield of polysaccharide from polygonatum was dependent variable；extraction process of polygonatum polysaccharide was optimized by Response surface methodology.By using immune suppressed mouse model the immunomodulatory effects of polysaccharide component were investigated. Resu lts The extracting time had the most significant effect on the extracting rate of PSP，and the optimum extraction process was as following：adding 20 times amount of water into crude medical material，extracting 2 h each time，then 0.6 cm2particle size.The extracting rate of PSP was 11.22%.Immunization results showed sibiricum can significantly improve the thymus index of mice，spleen index，phagocytic index.Conclusion Above-mentioned process is practical，which can provide reference for the utilization of Rhizoma Polygonati polysaccharide.

Polygonatum polysaccharide；Response surface methodology；Immune activity

R931.71

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.019

261021山东潍坊，解放军89医院妇产科（卜红南）