HPLC法测定复方阿胶膏中4种氨基酸的含量

张洁　白娟　朱倩云　李成网

[摘要]目的建立复方阿胶膏中4种的含量测定方法。方法采用HPLC法，Shimpack ODS C18柱（4.6mm×250mm，5um），以乙腈-0.1mol/L乙酸钠溶液（用冰乙酸调节pH值至6.5，7：93）为流动相A，以乙腈-水（4：1）为流动相B，进行梯度洗脱。结果L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸分别在12.46～124.6ug/mL、23.62～236.2ug/mL、8.47～84.7ug/mL、19.14～191.4ug/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999，n=6），平均加样回收率分别为97.91%、97.77%、97.67%、97.65%，RSD分别为1.70%、1.18%、1.31%、1.29%（n=9）。结论本法准确可靠，可用于复方阿胶膏的质量控制。

[关键词]高效液相色谱；复方阿胶膏；-羟脯氨酸；甘氨酸；丙氨酸；L-脯氨酸

复方阿胶膏为安徽中医药大学第二附属医院院内制剂，由阿胶、黄芪、枸杞子、核桃仁等八味中药组成，以养血益气为主，滋补肝肾、健胃消食、温肺润肠为辅。主用于气血两虚证所致的诸多疾病。其中阿胶为君药，阿胶中的主要有效成分为蛋白质、多肽和氨基酸。该方原采用凯氏定氮法测总氮含量为质量标准，但由于该制剂为复方制剂，干扰较大，该方法测得的结果误差较大，不够准确。因此在参考文献的基础上，于2015年10月～2016年1月期间，采用HPLC法以甘氨酸、丙氨酸、L-羟脯氨酸和L-脯氨酸四种阿胶中含量较高的氨基酸为定量指标，对复方阿胶膏进行质量标准研究。

1.仪器与试药

LC-20ATvp岛津液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD-20Avp检测器（日本岛津公司）；梅特勒AG285电子分析天平（瑞士）；梅特勒xp56型百万分之一电子天平（瑞士）；JK-300型超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）。复方阿胶膏（安徽中医药大学第二附属医院，批号：20150306、20150313、20150320），缺阿胶阴性制剂为自制。L一羟脯氨酸对照品（批号110766-200518）、甘氨酸对照品（批号110805-200306）、丙氨酸对照品（批号110780-200506）、L-脯氨酸对照品复（批号111626-200906）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1色谱条件嘲

色谱柱：Shimpack ODS C18柱（4.6mm×250mm，5um）；检测波长：254nm；流动相：以乙腈-0.1mol/L乙酸鈉溶液（用冰乙酸调节pH值至6.5，7：93）为流动相A，以乙腈-水（4：1）为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；进样量：10uL；柱温：43℃。

2.2对照品溶液的制备

精密称取甘氨酸、丙氨酸、L-羟脯氨酸、L-脯氨酸对照品适量，加0.1mol/L的HCl溶液制成每lmL含甘氨酸110ug、丙氨酸40ug、L-羟脯氨酸50ug、L-脯氨酸90ug的混合对照品溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

取样品1g，精密称定，置25mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液20mL超声使溶解，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。精密量取5mL，加盐酸5mL，150℃水解1h，放冷，移至蒸发皿中，用水10mL分次洗涤容器，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

2.4阴性供试品溶液的制备

取缺阿胶的阴性制剂1g，同法制成阴性供试品溶液。

2.5柱前衍生化

精密量取上述溶液各5mL，分别置25mL量瓶中，分别加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5mL和lmol/L三乙胺的乙腈溶液2.5mL，摇匀，室温放置1h后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10mL，加正己烷10mL振摇萃取，放置10min，分取下层液，滤过，取续滤液，即得。

2.6系统适应性试验

分别精密吸取衍生化后的混合氨基酸对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各10uL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果理论塔板数按甘氨酸计N=8725，分离度R=2.7，拖尾因子t=1.03。阴性供试品溶液无干扰。色谱图见图1。

2.7线性考察

精密称取甘氨酸对照品5.906mg、丙氨酸对照品2.118mg、L-羟脯氨酸对照品3.115mg、L-脯氨酸对照品4.784mg，置25mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含甘氨酸236.2ug/mL、丙氨酸84.7ug/mL、L-羟脯氨酸124.6ug/mL、L-脯氨酸191.4ug/mL的混合对照品溶液，分别精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL置10mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取上述混合对照品溶液各10uL，依次注入液相色谱仪中，依法测定，记录峰面积积分值，以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算线性回归方程分别为：甘氨酸A=20963C-39112（R=0.9999，n=6）；丙氨酸A=15000C-31897（R=0.9999，n=6）；L-羟脯氨酸A=12997C-14346（R=0.9999，n=6）；L-脯氨酸A=12997C-14346（R=0.9999，n=6）。结果：甘氨酸在23.62～236.2ug/mL范围内；丙氨酸在8.47～84.7ug/mL范围内；L-羟脯氨酸在12.46～124.6ug/mL范围内；L-脯氨酸在19.14～191.4ug/mL范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.8精密度试验

取供试品溶液，衍生化处理后，精密吸取同一供试品溶液10uL，连续进样6次，依法测定，记录4种氨基酸的峰面积，计算。结果：L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的RSD分别为0.46%、0.46%、0.43%、1.03%，说明仪器精密度良好。

2.9稳定性试验

取供试品溶液，衍生化处理后，置室温下放置，分别于配制后0、2、4、6、8、lOh，精密吸取10uL依法测定，记录峰面积，计算。结果：L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的RSD分别为0.52%、0.69%、0.43%、0.96%，说明供试品溶液中的4种氨基酸在室温下10h内稳定。

2.10重现性试验

取同一批样品，平行6份，分别依法制备供试品溶液，衍生化处理，分别精密吸取10uL依法测定，计算含量。结果：L-羟脯氨酸平均含量为6.74mg，g，RSD=1.34%、甘氨酸平均含量为14.37mg/g，RSD=0.80%、丙氨酸平均含量为5.22Mg/g，RSD=1.55%、L-脯氨酸平均含量为11.23mg/g，RSD=1.12%。说明本方法重现性良好。

2.11日间精密度试验

取同一批样品共6份，分别由不同操作人员在不同时间依法制备供试品溶液，衍生化处理，依法测定，计算含量，结果：L-羟脯氨酸日间平均含量为6.76mg/g，日间RSD=1.18%、甘氨酸日间平均含量为14.30mg/g，日间RSD=0.89%、丙氨酸日间平均含量为5.14mg，g，日间RSD=1.06%、L-脯氨酸日间平均含量为11.25mg/g，日间RSD=0.40%。说明本方法日间精密度良好。

2.12加样回收率试验

取重现性样品约0.5g，平行9份精密称定，分别置25mL量瓶中，精密加入混合对照品适量，依法制备、测定、计算回收率，见表2～5。

试验结果表明：加样回收率良好，供试品溶液的制备过程不影响各氨基酸的含量。

2.13樣品测定

取中试样品，依法测定各氨基酸含量，计算。结果：L-羟脯氨酸的含量分别为6.78、6.70、6.62mg/g；甘氨酸的含量分别为14.78、14.49、14.37mg/g；丙氨酸的含量分别为4.75、4.83、4.92mg，g；L-脯氨酸的含量分别为11.19、11.12、11.30mg/g。

3.讨论

2015年版中国药典规定阿胶药材按干燥品计算，含L-羟脯氨酸不得少于8.0%，甘氨酸不得少于18.0%，丙氨酸不得少于7.0%，L-脯氨酸不得少于10.0%。故制剂中各氨基酸的最低理论含量分别为L-羟脯氨酸8.0mg/g、甘氨酸18.0mg/g、丙氨酸7.0mg/g、L-脯氨酸10.0mg/g。根据3批中试样品的测定结果，考虑到制剂过程中的损失，将本制剂中各氨基酸的含量限度暂定为：本品每1g中含L-羟脯氨酸不得少于5.0mg/g，甘氨酸不得少于10.0mg/g，丙氨酸不得少于3.0mg/g，L-脯氨酸不得少于8.0mg/g。

供试品溶液制备过程中需在150℃水解1h，本文采用的是顶空进样瓶密封后置烘箱中加热水解，也有文献报道采用安剖瓶密封后水解。此外，笔者还考察了柱前衍生化后正己烷的萃取次数对测定影响，发现萃取1次，2次，3次对结果没有影响。另有文献报道，柱前衍生化法可同时测定阿胶中17种氨基酸的含量，本文也进行了相关实验，但发现除了甘氨酸、丙氨酸、L-羟脯氨酸和L-脯氨酸以外，其他氨基酸含量均较低，且相互分离度和峰型也不佳。考虑到不同产地和批次的药材差异，以及文献报道均为阿胶单昧药材的含量测定，而本文讨论的是复方制剂的含量测定，处方中其他药味的化学成分，水解后都会对氨基酸的测定造成干扰，故未收载其他氨基酸的含量测定。

本文使用的流动相参考了2015版中国药典一部阿胶项下的流动相，但按照药典规定的梯度洗脱步骤，丙氨酸和L-脯氨酸的分离度达不到R>1.5的要求，经不断调整发现，流动相的比例，酸度和柱温都对氨基酸的峰型、保留时间和分离度均有显著影响。尤其是柱温，低于40℃或者高于45℃，都会减小丙氨酸和L-羟脯氨酸的分离度，只有在43℃时，分离度达到最大。因此在实验中应严格控制柱温和环境温度，以保证分析效果最佳。

本方法可为含阿胶的复方制剂建立质量控制标准提供参考。但由于实验条件有限，还有很多工作有待进一步完善，未来还计划使用氨基酸专用色谱柱、蒸发光散射检测器、氨基酸分析仪等，对复方阿胶膏中的多种氨基酸进行分析及定量。