蛹虫草富铁液体深层发酵条件的优化

李慧英

（南通理工学院，江苏南通226002）

蛹虫草富铁液体深层发酵条件的优化

李慧英

（南通理工学院，江苏南通226002）

蛹虫草和铁元素被证明对人体有着重要的生理作用。通过设计单因素和多因素正交试验，探讨蛹虫草富铁液体深层发酵条件的优化。试验证实，蛹虫草富铁液体深层发酵的最佳培养基配方为：大豆粉35 g/L、蔗糖30 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO41.5g/L、硫胺素5×10-5g/L、FeSO4·7H2O 0.3 g/L。最佳培养条件为：pH6，温度26℃，发酵3 d，接种量5%，装液量100mL/250mL三角瓶。在此发酵条件下，测得富铁蛹虫草生物量为18.93 g/L，富集铁为16.01mg/g。

蛹虫草；富铁；液体深层发酵；优化

近年，冬虫夏草价格高涨，市场资源更加紧缺。由于其规模化人工培养还未实现，所以寻找冬虫夏草的替代品成为一种弥补途径。很多研究显示[1-2]，蛹虫草中含有核苷类化合物（虫草素、腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷等）、虫草多糖、虫草酸（D-甘露醇）、氨基酸、SOD酶等多种生物活性物质，在抗炎、抗癌、抗菌、增强免疫等方面与冬虫夏草具有相仿的功效。目前，我国市场上已有200多家企业在开发和生产蛹虫草，且不良反应报道不多[3]，所以可用蛹虫草替代冬虫夏草。对蛹虫草的研究文献较多，但蛹虫草富铁的培养还鲜见报道。铁作为人体最重要的微量元素之一，在体内含量最高。一个成人每天需吸收1mg以上的铁才可以满足生理需求[4]。本研究通过试验，优化蛹虫草富铁液体深层发酵的营养及培养条件，为其放大培养提供借鉴。

1 材料

1.1 菌种

蛹虫草菌种来自中国科学院北京微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

PDA培养基（g/L）：土豆200 g煮沸15min八层纱布过滤，葡萄糖20，硫胺素5×10-5，MgSO41.5，KH2PO41.5，琼脂粉20，调整初始pH6。121℃下灭菌20min。

1.2.2 种子培养基

PDA优化培养基（g/L）：土豆200 g煮沸15min八层纱布过滤，葡萄糖20，蛋白胨20，硫胺素5×10-5，KH2PO41.5，MgSO41.5，FeSO4·7H2O 0.3，调整初始pH6。121℃下灭菌20min。

1.2.3 摇瓶发酵培养基

同1.2.2种子培养基。

2 方法

2.1 蛹虫草培养

母种斜面培养：接种环划线接种PDA斜面，26℃培养5 d～7 d。

液体种子培养：接种环划线接种PDA平板，26℃培养5 d～7 d。切取平板菌两小块（约8mm2）于装液量100mL/250 mL三角瓶中，26℃、150 r/min摇床培养48 h至菌液清亮（出现稠密且大小均匀的菌丝球）。

发酵培养：接种量5%，在装液量100mL/250mL三角瓶中，26℃、150 r/min下，培养3 d。

2.2 富铁蛹虫草菌丝生物量的测定及菌丝体粉的制备

据前期蛹虫草耐铁试验结果，在发酵培养基中添加0.3 g/LFeSO4·7H2O进行蛹虫草液体深层发酵。发酵液离心5min（转速10 000 r/min），倾去上清液，将菌丝球捣碎至泥状，加去离子水10mL，再离心5min（转速10 000 r/min），如此反复3次。将收集的菌丝置于干燥箱中烘干至恒重，称干重即为生物量。粉碎菌丝过60目筛，得到的菌丝体粉用于其他有效成分测定。

2.3 菌丝铁含量测定

用邻二氮菲比色法测定[5]。

2.4 单因素试验

2.4.1 碳源种类及浓度对蛹虫草生物量和富集铁的影响

在蛹虫草发酵培养基中，分别添加20 g/L的葡萄糖、果糖、乳糖、糊精、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉替代基础培养基的碳源，发酵培养3 d，测定菌丝体的生物量和富集铁，确定出最优碳源。设置最优碳源浓度分别为10、20、30、40、50 g/L进行试验，确定最佳浓度。

2.4.2 氮源种类及浓度对蛹虫草生物量和富集铁的影响

菌种液体深层发酵时添加的氮源分无机氮和有机氮，大多数菌种在无机氮中长势没有有机氮好[5-7]。蛹虫草培养基中添加最优碳源，分别添加大豆粉、蚕蛹粉、蛋白胨、酵母浸膏、玉米浆5种有机氮源，于26℃，转速150 r/min下发酵培养3 d，测定菌丝体的生物量和富集铁，确定最优氮源。调整培养基中最优氮源浓度为10、20、30、40、50 g/L进行试验，确定最佳浓度。

2.4.3 发酵温度对蛹虫草生物量和富集铁的影响

培养基中添加最优碳源、氮源，蛹虫草培养的初始温度分别调整为22、24、26、28、30℃，在150 r/min转速下发酵3 d，测定蛹虫草的生物量和富集铁，确定最佳培养温度。

2.4.4 接种量对蛹虫草生物量和富集铁的影响

培养基中添加最优碳源、氮源，调整最佳培养温度，分别在培养基中接入l%、3%、5%、7%、10%的接种量，150 r/min转速下发酵3 d，测定不同接种量下富铁蛹虫草的生物量和富集铁，确定富铁蛹虫草的最佳接种量。

2.4.5 装液量对蛹虫草生物量和富集铁的影响

在最优碳源、氮源、温度及接种量条件下，分别装入250mL三角瓶的60、80、100、120、140mL容量的发酵液，150 r/min转速下发酵3 d，测定不同装液量下富铁蛹虫草菌丝体的生物量和富集铁，确定出富铁蛹虫草培养的最佳装液量。

2.4.6 培养基pH值对蛹虫草生物量和富集铁的影响

在最优碳源、氮源、温度、接种量及装液量条件下，分别调整培养基的初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，150 r/min转速下发酵3 d，测定不同初始pH值培养基的蛹虫草的生物量和富集铁，确定出富铁蛹虫草培养基的最佳初始pH值。

2.5 多因素正交试验

根据单因素试验结果进一步设计正交试验以优化蛹虫草的培养。

3 结果与分析

3.1 碳源的影响

分别添加20 g/L的不同碳源培养富铁蛹虫草，测定其菌丝生物量和富集铁结果见图1和图2。

图1 不同碳源对生物量的影响Fig.1 Effectof different carbon sourceson thebiomass

图2 不同碳源对富集铁的影响Fig.2 Effectof different carbon sourceson theenrichmentof iron

如图1和图2所示，不同碳源对蛹虫草富集铁的影响不大，但对其生物量影响较大。以生物量为考察指标时，添加不同碳源富铁蛹虫草的生物量大小依次为：蔗糖＞糊精＞可溶性淀粉＞葡萄糖＞乳糖＞果糖。以富集铁为考察指标时，添加不同碳源富铁蛹虫草的富集铁大小依次为：蔗糖＞糊精＞葡萄糖＞乳糖＞可溶性淀粉＞果糖。

从菌丝球长势看，蔗糖作为碳源菌丝球最大，菌丝球密度高，发酵液也比较清澈。而可溶性淀粉和糊精做为碳源时，发酵液较黏稠，有较多碳源沉淀，影响了虫草生物量的测定。综上所述，选蔗糖作为最优碳源。

富铁蛹虫草培养基中分别设置蔗糖浓度为10、20、30、40、50 g/L进行试验，测定富铁蛹虫草的生物量和富集铁结果如图3和图4。

图3 不同碳源浓度对生物量的影响Fig.3 Effectof different concentrationsof carbon sourceson the biom ass

图4 不同碳源浓度对富集铁的影响Fig.4 Effectof different concentrationsof carbon sourceson the enrichmentof iron

由图3所知，以生物量为考察指标时，添加不同浓度蔗糖富铁蛹虫草的生物量依次为：30 g/L＞40 g/L＞50 g/L＞20 g/L＞10 g/L。由图4所知，以富集铁为考察指标时，添加不同浓度蔗糖富铁蛹虫草的富集铁依次为：30 g/L＞40 g/L＞20 g/L＞50 g/L＞10 g/L。由图判断，蔗糖浓度的变化对蛹虫草富集铁的影响不明显，对生物量的影响相对明显。综合考虑，选择蛹虫草富铁过程中蔗糖浓度添加30 g/L最佳。

3.2 氮源的影响

富铁蛹虫草培养基中添加30 g/L不同种类的有机氮源，测得生物量和富集铁如图5和图6所示。

图5 不同氮源对生物量的影响Fig.5 Effectof differentnitrogen sourceson thebiom ass

图6 不同氮源对富集铁的影响Fig.6 Effectof differentnitrogen sourceson theenrichm entof iron

从试验结果可知，不同的氮源对发酵蛹虫草的生物量影响比较大，但对蛹虫草富集铁元素的影响相对较小。从图5来看，不同氮源对生物量的影响依次为：大豆粉＞玉米浆＞蚕蛹粉＞蛋白胨＞酵母浸膏。从图6来看，不同氮源对富集铁的影响依次为：大豆粉＞蚕蛹粉＞蛋白胨＞酵母浸膏＞玉米浆。

观察蛹虫草的长势，大豆粉为氮源时长势最好，玉米浆为氮源时长势最差。以玉米浆为氮源生物量较高，因为发酵液较黏稠不能与菌丝球很好的分离造成的。综合考虑，判定以大豆粉为氮源最优。

为了考察大豆粉浓度变化对富铁蛹虫草的生物量、富集铁和生长的影响，本试验在发酵培养基中分别添加浓度为10、20、30、40、50 g/L的大豆粉，测定富铁蛹虫草的生物量和富集铁，结果如图7和8所示。

图7 不同氮源浓度对生物量的影响Fig.7 Effectof different concentrationsof nitrogen sourceson the biom ass

由图7所示，大豆粉浓度为30 g/L时，蛹虫草的生物量最大。图8所示，大豆粉浓度为40 g/L时，蛹虫草富铁量最高。大豆粉浓度为30 g/L或40 g/L，蛹虫草的富集铁相差不大，所以选择培养基中大豆粉的最佳浓度为30 g/L。

图8 不同氮源浓度对富集铁的影响Fig.8 Effectof different concentrationsofnitrogen sourceson the enrichm entof iron

3.3 温度的影响

发酵液初始温度不同，富铁蛹虫草的生物量和富集铁变化不大，结果如图9和图10。

图9 不同温度对生物量的影响Fig.9 Effectof different tem peratureon thebiomass

图10 不同温度对富集铁的影响Fig.10 Effectof different temperatureon theenrichmentof iron

如图9和10所示，发酵温度改变时，温度从22℃升高到26℃时，蛹虫草菌丝的生物量和富集铁都趋缓升高，继续升高温度，蛹虫草菌丝生物量和富集铁值都逐渐下降，26℃时菌丝生物量和富集铁都达到最大。其中24℃时，平行试验中有一组数据生物量和富集铁都相对其他两组数据偏小，分析可能是菌种污染影响了蛹虫草的生长。因此，富铁蛹虫草培养确定26℃为最适温度。

无机锚固胶：采用NK尼高无机锚固胶，相关安全性能指标和工艺性能标准应符合GB 50728—2011《工程结构加固材料安全性鉴定技术规范》第4.2节和第4.8节中Ⅰ类A级胶的规定，相关技术要求应符合JGJ/T 271—2012《混凝土结构工程无机材料后锚固技术规程》的相关规定。

3.4 接种量的影响

图11和图12为分别以l%、3%、5%、7%、10%的接种量培养富铁蛹虫草时的生物量和富集铁的变化图。

图11 接种量对生物量的影响Fig.11 Effectof inoculum on thebiomass

图12 接种量对富集铁的影响Fig.12 Effectof inocu lum on theenrichmentof iron

由图11和图12可知，接种量达到5%时，富铁蛹虫草的富集铁和生物量都达到最大值，而随着接种量的降低或升高，生物量和富集铁都会不同程度的降低。所以，蛹虫草富铁培养时选择5%的接种量最适合。

3.5 装液量的影响

在250mL三角瓶中分别装入60、80、100、120、140mL的培养液培养富铁蛹虫草，结果如图13和图14。

由图13和图14可知，装液量的多少也会影响蛹虫草生物量和富集铁，装液量100mL/250mL时，生物量和富集铁达到最大值，所以选择100mL/250mL的装液量最适。

3.6 初始pH值的影响

将蛹虫草的培养基初始pH值分别调整为4、5、6、7、8时，结果蛹虫草培养的生物量和富集铁如图15和图16。

图13 装液量对生物量的影响Fig.13 Effectof liquid volumeon thebiomass

图14 装液量对富集铁的影响Fig.14 Effectof liquid capacity on theenrichmentof iron

图15 pH值对生物量的影响Fig.15 Effectof pH on thebiomass

图16 pH值对富集铁的影响Fig.16 EffectofpH on theenrichmentof iron

由图15和图16可知，当初始pH值在4～6时，蛹虫草的菌丝体干重和富集铁含量随着初始pH的升高而增大；当初始pH值达到6时，蛹虫草的菌丝体干重和富集铁量均达到最大；当初始pH值在6～8时，蛹虫草的菌丝体干重和富集铁量随着初始pH值的升高而减小。因此确定pH6为最适pH值。

3.7 多因素正交试验

蛹虫草富铁的单因素试验结果显示，大豆粉、蔗糖、接种量、装液量这4个影响因素对富铁蛹虫草的生物量和富集铁影响较显著。为了进一步考察4个因素不同水平对蛹虫草富铁发酵的影响，确定出最佳培养基组合，本试验采用每个因素设置3个水平，其因素水平如表1，设计正交表L9（34）安排正交试验。

L9（34）正交试验及其结果如表2，生物量为考察指标的各因素水平趋势图如图17所示，富集铁为考察指标的各因素水平趋势图如图18所示。

表1 正交试验因素水平表L9（34）Table1 The L9（34）tableof factorsand levelsof orthogonal experim ents

表2 L9（34）正交试验及其结果表Table2 The L9（34）tableof orthogonalexperimentsand its resu lts

蛹虫草富铁培养的生物量和富集铁的极差计算结果见表2，比较各R值大小，可见RA＞RB＞RD＞RC，所以因素对试验指标影响的主→次顺序是ABDC。即大豆粉影响最大，其次是蔗糖，再次是装液量，而接种量的影响较小。大豆粉、蔗糖、装液量是富铁蛹虫草培养中生物量和富集铁的主要影响因素，而接种量是次要因素。

见因素水平趋势图17和图18，以生物量为考察指标，较优水平组合为A3B2C2D2。以富集铁作为考查指标，较优水平组合为A3B3C2D2。正交试验的主要指标是生物量，次要指标是富集铁，两指标都是越大越好。对照表2，最优组合A3B2C2D2在已做过的试验中未有出现，与它比较接近的是第8号和9号试验。

表3和表4为生物量和富集铁的方差分析结果。

图17 生物量为考察指标的因素水平趋势图Fig.17 The level factor trend by biomassas index

图18 富集铁为考察指标的因素水平趋势图Fig.18 The level factor trend by theenrichmentof iron as index

可以看出，大豆粉、蔗糖、装液量对于蛹虫草富铁培养的生物量和富集铁都有显著的影响，大小依次为大豆粉＞蔗糖＞装液量，而接种量对蛹虫草富铁培养的生物量和富集铁影响不大。所以也不能通过方差分析结果判断第8号试验和第9号试验哪个是最优方案。为了进一步验证分析结果，重新安排最优方案A3B2C2D2的蛹虫草富铁培养试验，测的其生物量为18.93 g/L，富集铁为16.01mg/g，高于正交试验的全部结果。得出，蛹虫草富铁培养的最佳组合为：大豆粉35 g/L，蔗糖30 g/L，接种量为5%，装液量为100mL/250mL。

表3 生物量方差分析表Table3 The varianceanalysising tableof biom ass

表4 富集铁方差分析表Table4 The varianceanalysising tableof theenrichmentof iron

4 结论

通过设计单因素、多因素试验，研究了蛹虫草富铁液体摇瓶发酵过程中各营养条件和培养条件对蛹虫草生物量和富集铁的影响，确定蛹虫草富铁的最佳营养条件为：大豆粉35g/L，蔗糖30 g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO41.5 g/L，硫胺素5×10-5g/L，FeSO4·7H2O 0.3 g/L。最佳培养条件为：pH 6，培养温度26℃，培养时间3 d，接种量5%，装液量每100mL/250mL三角瓶。在此条件下，进行蛹虫草富铁的摇瓶发酵试验，测得富铁蛹虫草的生物量为18.93 g/L，富集铁为16.01mg/g，高于其他营养和培养条件下发酵的生物量和富集铁。为蛹虫草富铁大规模培养提供一定的借鉴。

[1]王奇.蛹虫草功效成分研究进展[J].辽宁师专学报,2011,13(3)：103-106

[2]杨雨亭.蛹虫草与冬虫夏草营养及功效特性相似[N].中国食品报,2011-11-09(4)

[3]马吴伟,潘苏华.蛹虫草研究进展[J].亚太传统医药,2008,4(11)：148-150

[4]王雅利.铁的失衡与人体健康[J].中国食物与营养,2006(7)：57-58

[5]陈九山.灵芝发酵、富铁条件优化及栽培[D].合肥：合肥工业大学, 2009：1-40

[6]袁玉兰,郭雪娜,张博润,等.高生物量富铁酵母菌的选育及其发酵条件的研究[J].工业微生物,2004,34(4)：29-33

[7]袁红莉.高效富集镉菌株的筛选及其富集特征[D].北京：中国农业大学,2003

The Optim ization of Submerged Fermentation Condition of Iron-riched Cordycepsm ilitaris

LIHui-ying
（Nantong Polytechnic College，Nantong 226002，Jiangsu，China）

As Cordycepsmilitaris and iron elementhave been proved to have importantphysiological functions tohuman body.Through designing the single factorandmulti-factororthogonalexperiments to explore the optimization of submerged fermentation condition of iron-riched Cordycepsmilitaris.The best culturemedium formula of submerged fermentation had been determined by experiments as follows：soybeanmeal 35 g/L，sugar 30 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.5 g/L，thiamine 5×10-5g/L，FeSO4·7H2O 0.3 g/L.The bestculture condition had been achieved as follows：pH6，temperature 26℃，fermentation 3 days，inoculation quantity 5%，fluid volume 100 mL/250 mL of triangle flask.Under the optimal conditions of the submerged fermentation，itwas measured that the biomass of iron-riched Cordycepsmilitaris was 18.93 g/L，and the enrichment of iron was 16.01mg/g.

Cordycepsmilitaris；iron-riched；submerged fermentation；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.034

2016-06-23

李慧英（1982—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：生物制药。