胰酶明胶水解物对甲醛捕获特性的研究

王嵬，杨立平，仪淑敏，*，李学鹏，李颖畅，励建荣，*

（1.渤海大学实验管理中心，辽宁锦州121013；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013）

胰酶明胶水解物对甲醛捕获特性的研究

王嵬1，杨立平2，仪淑敏2，*，李学鹏2，李颖畅2，励建荣2，*

（1.渤海大学实验管理中心，辽宁锦州121013；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013）

研究不同反应时间、温度、pH值和明胶浓度对明胶与甲醛反应的影响，结果表明，在30℃、pH8.0、明胶浓度0.8%时，反应活性较好，延长反应时间有利于明胶与甲醛的反应。优化了胰酶水解明胶及其捕获甲醛的最佳条件，表明加酶量、底物浓度、水解时间对反应影响显著，确定了甲醛捕获率与氨基氮含量呈正相关性。红外光谱分析得出水解后图谱的吸收峰明显增多了，氨基N-H伸缩振动的吸收峰和羧酸盐羧基C=O伸缩振动吸收峰明显增强，表明胰酶水解明胶的反应发生了，且水解明胶的游离羧基和氨基明显增加。

明胶；胰酶；甲醛

甲醛（Formaldehyde，FA）又称蚁醛，微带酸性，具有强烈的刺激性气味，被世界卫生组织确定为致畸、致癌物质，是公认的变态反应源，也是潜在的强致突变物之一。国内外学者发现某些食品如香菇、水产品等自身含有一定量的甲醛。并在贮存加工过程中如果方法不当，会导致甲醛含量会有不同程度的增长[1-5]。

一种良好的甲醛捕获剂应该具备以下条件：高效且用量小；无二次污染，添加后不影响产品品质；其主要成分与内源性甲醛反应后生成的化合物具有很好的稳定性；具有良好的水溶性；成本低[6]。

明胶分子中含有氨基、羧基，有的还有疏水基团、亲水基团、胍基、直链烷烃、酸性基团、碱性基团、分子间氢键和分子内氢键[7]，决定了其易与甲醛发生反应，由于其溶液中的氨基数量有限，决定了反应一段时间后，达到饱和状态，即甲醛去除率达到最大值。为解决这一问题，让其暴露出更多的活性基团，提高除去甲醛的效果，需对其进行水解。考虑到明胶作为甲醛捕获剂将应用于食品中，传统的酸法和碱法水解都不适合，故本试验选用酶法水解明胶。任龙芳[8]用酸法、碱法、酶法水解胶原蛋白，发现复合酶水解的产物甲醛去除率效果最好。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胰酶（食品级，4 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；明胶：国药集团化学试剂有限公司；2，4-二硝基苯肼、甲醛标准溶液（100 mg/L）、氢氧化钠、浓盐酸：分析纯；甲醇、乙腈均为色谱纯。

Agilent HPLC1260高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；380FT-IR型红外光谱仪：美国Thermo公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；MS105DU分析天平：METTLER TOLEDO公司。

1.2 方法

1.2.1 明胶的水解

将明胶配制成一定浓度的溶液，置于水浴恒温振荡器中，待明胶完全溶胀后，调至胰酶的最适使用条件使其水解，水解完成后，将水浴锅升温至90℃左右，保温5 min，使酶失活，冷却即得水解明胶。

1.2.2 胰酶水解明胶条件优化

1.2.2.1 不同水解时间胰酶对明胶水解效果的影响

胰酶水解条件：温度45℃，物料浓度20%，pH7.5，加酶量1.0%（以物料干重计）。按照1.2.1的水解方法水解明胶，反应每隔1小时，吸取水解明胶样品2.5mL，按照1.2.3的方法测定氨基氮含量；吸取水解明胶样品2.5 mL，用水定容至50 mL，按照1.2.4的方法测定甲醛捕获率。

1.2.2.2 不同水解温度对明胶水解效果的影响

胰酶水解条件：时间5 h，物料浓度20%，pH7.5，加酶量1.0%（以物料干重计），水解温度30、35、40、45、50、55℃。明胶水解方法、测定氨基氮含量和甲醛捕获率的方法同1.2.2.1。

1.2.2.3 不同pH值对明胶水解效果的影响

胰酶水解条件：时间5 h，水解温度35℃，物料浓度20%，pH7.0、7.5、8.0、8.5，加酶量1.0%（以物料干重计）。明胶水解方法、测定氨基氮含量和甲醛捕获率的方法同1.2.2.1。

1.2.2.4 不同胰酶添加量对明胶水解效果的影响

胰酶水解条件：时间5 h，水解温度35℃，物料浓度20%，pH7.5，加酶量0.15%、0.2%、0.5%、0.8%、1.0%（以物料干重计）。明胶水解方法、测定氨基氮含量和甲醛捕获率的方法同1.2.2.1。

1.2.2.5 不同底物浓度对明胶水解效果的影响

胰酶水解条件：时间5 h，水解温度35℃，物料浓度15%、20%、25%、30%，pH7.5，加酶量0.8%（以物料干重计）。明胶水解方法、测定氨基氮含量和甲醛捕获率的方法同1.2.2.1。

1.2.2.6 析因试验设计

在单因素试验的基础上，为进一步研究时间、温度、pH值、加酶量、明胶浓度对明胶水解程度和明胶水解物与甲醛反应的影响，设计了五因素二水平的析因组合试验，考察时间、温度、pH值、胰酶添加量和明胶浓度对明胶水解率和甲醛捕获率的影响趋势，试验设计如表1。

1.2.2.7 响应面优化中心组合试验设计

在析因试验的基础上设计了三因素三水平的响应面中心组合试验，考察时间、胰酶添加量、明胶浓度对明胶水解度和甲醛捕获率的影响趋势，试验设计如表4。

1.2.3 氨基氮含量的测定[9]

明胶经过水解会暴露出氨基或羧基，可以利用氨基氮的量来表征水解程度。但其酸碱性太弱，所以不能采用酸碱直接滴定[10]。用甲醛来固定氨基，然后用NaOH来滴定羧基，反应式如下：

操作步骤：称取明胶水解物2.5 mL，加蒸馏水至50 mL，用0.050 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH值为8.2，记下用去的NaOH毫升数（V2），再向上述溶液中加入10 mL甲醛，混匀，再用0.050 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH值为9.2，记录加入甲醛后消耗的NaOH毫升数（V1）。同时用蒸馏水做空白，记录所消耗NaOH毫升数（V0）。按如下公式计算：

式中：V1为加入甲醛后消耗的NaOH溶液的体积，mL；V0为加入甲醛后空白液消耗NaOH溶液的体积，mL；C为NaOH溶液的物质的当量浓度，mol/L；M为样品的质量分数，g/mL；14.01为氮的摩尔质量，g/ mol；V为加入样品的体积，mL。

1.2.4 甲醛的测定

根据励建荣等[11]建立的方法略有改进，利用高效液相色谱法测定甲醛的含量，甲醛与2，4－二硝基苯肼于60℃水浴下衍生生成2，4－二硝基苯腙，经ODSC18柱分离，紫外检测器波长355 nm下检测，以保留时间定性，峰面积定量，间接测出甲醛含量。测定时取4 mL待测液，加入2，4－二硝基苯肼衍生剂2 mL，60℃下衍生30 min，流水冷却，0.45 μm滤膜过滤后，取10 μL进样检测。

标准曲线绘制：分别取10 mg/L甲醛标准液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、1.80、2.00、2.40、2.80、3.20、3.60、4.00 mL于比色管中，加水至4 mL，加入2，4－二硝基苯肼衍生剂2 mL，60℃水浴衍生30 min，流水冷却后过0.45 μm有机滤膜，进HPLC检测。以保留时间定性、峰面积定量，绘制标准曲线，结果见图1。

图1 甲醛标准曲线Fig.1 The standard cure of formaldehyde

1.2.5 傅里叶红外的测定

用旋转蒸发仪将经过胰酶水解的明胶水解物浓缩，得到水解物粉体。采用380FT－IR型红外光谱仪测定粉体明胶和明胶水解物的红外光谱。

1.2.6 数据处理

试验均重复3次，结果以均值±标准偏差表达。用Microsoft Excel和Origin 8.0进行数据处理和作图。利用SPSS18.0进行ANOVA，用来比较单因素各组间的差异，P＜0.05表示差异性显著，P＜0.01表示差异极显著；用Design－Expert 8.0.6软件进行析因试验设计和响应面分析。

2 结果与讨论

2.1 胰酶水解明胶条件的研究

对于明胶的水解，影响因素有很多，如水解时间、水解温度、pH值、胰酶添加量、明胶底物浓度等。以水解度和甲醛捕获率为指标，分别分析了不同因素对胰酶水解明胶效果的影响。

2.1.1 不同时间胰酶对明胶水解效果的影响

分析了胰酶分别在时间1、2、3、4、5、6 h下对明胶水解效果和明胶水解物对甲醛捕获率的影响，结果见图2。

图2 水解时间对明胶水解效果的影响Fig.2 Effect of different time on the gelatin hydrolysis

随着水解时间的增加，水解度和甲醛捕获率缓慢升高，5 h时均达到最高值；再增加时间，氨基氮含量增加趋于平稳，而甲醛捕获率反而减少，这可能是再进行深度水解的生成物不利于与甲醛发生反应，所以水解时间选择5 h。

2.1.2 不同温度胰酶对明胶水解效果的影响

分别在30、35、40、45、50、55℃条件下水解明胶5 h，结果见图3。

图3 水解温度对明胶水解效果的影响Fig.3 Effect of different temperature on the gelatin hydrolysis

氨基氮含量随着温度的升高逐渐升高，在45℃达到最大值，继续升高则水解度下降，表明最佳酶解温度在45℃左右；而甲醛捕获率随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，在35℃时达到最大值，显著高于其它温度下的值（P＜0.01）。由于本试验的目的是选取一种甲醛捕获剂，所以下一步试验温度选择35℃。

2.1.3 不同pH值胰酶对明胶水解效果的影响

因为每一种酶的等电点都不一样，都有最佳pH值使用范围，分析了胰酶在最佳pH值使用范围内，酶解明胶的效果和水解物与甲醛反应的能力，结果见图4。

图4 pH值对明胶水解效果的影响Fig.4 Effect of different pH value on the gelatin hydrolysis

从图4可以得到胰酶水解明胶在其最佳pH值范围内，水解度并没有显著性变化（P＜0.05）；而甲醛捕获率在pH值为7.5时显著高于其它pH值情况下的甲醛捕获率（P＜0.01），说明明胶在pH值为7.5时酶解物更容易与甲醛发生反应。所以选择pH值为7.5，并作进一步试验以确定最适水解条件。

2.1.4 不同胰酶添加量对水解效果的影响

固定其它水解条件不变，分别选取加酶量0.15%、0.2%、0.5%、0.8%、1.0%（以明胶物料干重计）水解明胶，结果见图5。

图5 酶添加量对明胶水解效果的影响Fig.5 Effect of different enzyme quantity on the gelatin hydrolysis

随着酶的添加量增加，水解度和甲醛捕获率呈显著增加的趋势（P＜0.05），当胰酶加入量为0.8%时，氨基氮含量和水解物的甲醛捕获率效果达到最大值，再增加胰酶量，氨基氮含量趋于稳定，甲醛捕获率相应减少（P＜0.05）。

2.1.5 底物浓度对胰酶水解明胶的影响

随着底物浓度的增加，氨基氮含量和甲醛捕获率均呈现先增加后减小的趋势，结果见图6。

图6 底物浓度对水解效果的影响Fig.6 Effect of different gelatin concentration on the gelatin hydrolysis

当底物浓度为20%时，氨基氮含量和甲醛捕获率均达到最大值（P＜0.01），继续增加底物浓度，又相应的显著减小（P＜0.01）。

2.1.6 析因试验

为进一步研究时间、温度、pH值、加酶量和明胶浓度对胰酶水解明胶能力和明胶水解物与甲醛反应显著性效果的影响，设计了五因素二水平的析因组合试验。试验设计及结果见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计表及结果Table 1 Plackett-Burman experiment design and results

从表1中可知当序号为3时，明胶的水解度和甲醛捕获率为最大值。

氨基氮含量方差分析见表2。

表2 氨基氮含量方差分析Table 2 ANOVA analysis of amino nitrogen content

由表2可知5个变量对响应值（氨基氮含量）模拟的模型是极显著的（P＜0.01），模型回归方程的相关系数为0.964 1，说明响应值变化有96.41%来源于所选取的变量。5个变量中有3个对氨基氮含量影响是极显著的（P＜0.01），分别是水解时间、加酶量、底物浓度，各因素对胰酶水解明胶的影响顺序是D＞A＞E＞B＞C，即加酶量＞水解时间＞底物浓度＞水解温度＞pH值。

甲醛捕获率的方差分析结果见表3。

由表3可知析因试验设计的五因素二水平试验对模型的响应值甲醛捕获率影响是极显著的（P＜0.01），模型回归方程的相关系数为0.892 9，说明响应值的变化有89.29%来源于所选变量。5个变量中有1个对响应值影响是极显著的（P＜0.01），是加酶量；有一个对响应值影响是显著的（P＜0.05），是水解时间。各因素对明胶水解物与甲醛反应的影响顺序是加酶量＞水解时间＞底物浓度＞pH值＞水解温度。

表3 甲醛捕获率方差分析Table 3 ANOVA analysis of formaldehyde capture rate

通过单因素试验及Plackett－Burman设计，对影响明胶水解度和明胶水解物与甲醛反应的诸多相关因子进行了评价，成功的筛选出加酶量、水解时间、底物浓度是影响明胶水解度的主要因子，加酶量、水解时间是影响甲醛捕获率的主要因子，为进一步优化工艺参数提供了重要的理论依据与实践基础。

2.1.7 最佳酶解条件的确定

在单因素和析因试验的基础上，选取了影响明胶水解度和甲醛捕获率较大的3个因素，分别是加酶量、水解时间、底物浓度，设计了三因素三水平的响应面组合试验，水解温度和pH值选取单因素甲醛捕获率最大值，分别是35℃、7.5。试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计与结果Table 4 Box-Behnken design and corresponding results

续表4 Box-Behnken试验设计与结果Continue table 4 Box-Behnken design and corresponding results

从表4中可知试验序号17的氨基氮含量和甲醛捕获率为试验的较大值。

响应面氨基氮含量方差分析结果见表5。

表5 氨基氮方差分析结果Table 5 ANOVA results of amino nitrogen content

从表5中可知响应面模拟的模型是极显著的（P＜0.01），且失拟项不显，模型回归方程的相关系数为0.926 6，说明响应值的变化有92.66%来源于所选变量。3个变量对氨基氮含量的影响是显著的（P＜0.05），水解时间与加酶量、加酶量与底物浓度的交互作用分别对响应值氨基氮含量影响是显著的（P＜0.05）。

响应面甲醛捕获率方差分析结果见表6。

表6 甲醛捕获率方差分析结果Table 6 ANOVA results of formaldehyde capture rate

续表6 甲醛捕获率方差分析结果Continue table 6 ANOVA results of formaldehyde capture rate

从表6中可知响应面模拟的模型是极显著的（P＜0.01），且失拟项不显，说明回归方程对试验结果拟合较好，模型回归方程的相关系数为0.876 9，说明响应值的变化有87.69%来源于所选变量。加酶量与底物浓度的交互作用对甲醛捕获率的影响是显著的（P＜0.05）。

通过Design expert 8.0软件综合3个指标的影响，对回归方程在试验范围内进行适当调整，得到最佳水解条件：温度35℃，pH值7.5，水解时间5 h，加酶量0.8%，底物浓度25%，氨基氮含量为1.45%，甲醛捕获率60.58%。

2.2 氨基氮含量与甲醛相关性的建立

甲醛与明胶水解物发生反应生成不稳定的氨基羟甲基加合物和氨基酸残基的硫醇基团，赖氨酸和色氨酸残基上的部分羟甲基脱水生成不稳定的席夫碱，而席夫碱能够稳定的与氨基酸残基交联[12]。氨基氮含量与甲醛相关性的建立是从表4选取9个点得出的，结果见图7。

图7 氨基氮含量与甲醛捕获率的关系Fig.7 The relation of amino nitrogen content and formaldehyde capture rate

随着氨基氮含量的增加，甲醛捕获率也相应的增加，氨基氮含量与甲醛捕获率变化趋势基本相同，所以氨基氮含量与甲醛捕获率呈正相关，适当的增加氨基氮含量有利于提高甲醛捕获率。

2.3 红外谱图的分析

将胰酶水解得到的明胶水解物于旋转蒸发仪中脱水，采用溴化钾压片法将明胶和水解明胶进行红外检测，并对比水解前后的结构变化，结果见图8。

图8 明胶和明胶水解物的红外图谱Fig.8 IR spectrum of gelatin and gelatin hydrolysates

其中3 370 cm-1处强而宽的酰胺带主要与N-H的伸缩振动有关；1 645 cm-1处的吸收峰为羧酸盐羧基的C=O的伸缩振动吸收峰；1 542 cm-1处为酰胺带C-N伸缩和N-H弯曲振动，1 453 cm-1处为-CH2-和-CH3弯曲振动；1 397 cm-1、1 336 cm-1、1 226 cm-1处的吸收峰是来自于C-N伸缩振动和骨架N-H弯曲振动，以及肽链骨架上和脯氨酸中的CH2的摇摆震动；1 074 cm-1处为C-O伸缩振动。从水解前后的红外光谱可以看出水解后图谱的吸收峰明显增多了，氨基N-H伸缩振动的吸收峰、羧酸盐羧基C=O伸缩振动吸收峰明显增强，说明水解明胶的游离羧基和氨基明显增加，从而表明胰酶水解明胶的反应发生了。

3 结论

1）胰酶水解明胶最佳条件为：温度35℃，pH7.5，水解时间5 h，加酶量0.8%，底物浓度25%，氨基氮含量1.45%，甲醛捕获率60.58%。

2）随氨基氮含量的增加，甲醛捕获率相应的增加，甲醛捕获率与氨基氮含量呈正相关。

3）红外光谱分析得出明胶水解后图谱的吸收峰明显增多了，氨基N-H伸缩振动的吸收峰和羧酸盐羧基C=O伸缩振动吸收峰明显增强，表明胰酶水解明胶的反应发生了，且水解明胶的游离羧基和氨基明显增加。

[1] 夏苗,励建荣,张蕾,等.气调包装对香菇保鲜期内源性甲醛含量的影响[J].中国食品学报,2012,12(4):127-133

[2] 励建荣,宋君,黄菊,等.香菇甲醛代谢关键酶活性与甲醛含量的变化[J].中国食品学报,2013,13(8):213-218

[3]魏建华,林隆强,陈燕勤.丁鱼及其鱼丸制品中甲醛的天然含量及风险评估[J].食品工业,2014,35(6):183-185

[4]韩冬娇,李敬,刘红英.不同贮藏温度对南美白对虾中甲醛含量变化的影响[J].食品工业科技,2016,37(2):335-338,342

[5] Rodriguez.Studies on the principal degration Products of trimethylamine oxide in four species of refrigerated fish[J].Food and Feed Chemistry,1997,288:131-135

[6] 张换换,刘浪浪,刘军海.甲醛捕捉剂的研究热点和发展方向[J].中国环保产业,2010(1):51-54

[7] 张宏森,周扬,张钢.精氨酸的电子结构和光谱性质[J].黑龙江科技学院学报,2010,20(3):207-215

[8]任龙芳.基于废弃皮胶原改性的甲醛捕获剂的制备及其捕获行为的研究[D].西安:陕西科技大学,2011

[9]中华人民共和国国家质量技术监督局.GB 18186-2000酿造酱油[S].北京:中国标准出版社,2002

[10]冯志川,刘艳红.测量食醋中氨基酸态氮时甲醛用量的探讨[J].中国调味品,2000(9):27-28

[11]Li J R,Zhu J L,Ye L R.Determination of formaldehyde in squid by highperformance[J].Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition,2007, 16(1):127-130

[12]MetzB,KerstenGFA,HoogerhoutP,etal.Identificationof formaldehyde-induced modifications in proteins:reactions with model peptides[J].Journal Of Biological Chemistry,2004,279:6235-6243

The Capture Properties of Gelatin Hydrolysates by Tyrisin Enzyme on Formaldehyde

WANG Wei1，YANG Li-ping2，YI Shu-min2，*，LI Xue-peng2，LI Ying-chang2，LI Jian-rong2，*
（1.Laboratory Management Center，Bohai University，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.College of Food Science and Engineering，Bohai University，Jinzhou 121013，Liaoning，China）

Reaction of gelatin with formaldehyde was studied at different reaction time，temperature，pH value and gelatin concentration.The results showed that the activity of formaldehyde capture properties were higher at the condition of 30℃，pH value of 8.0，concentration of 0.8%.The action of tyrisin enzyme hydrolysis was thebest through the deep hydrolyzed of gelatin.The optimum conditions of gelatin hydrolysis by tyrisin and formaldehyde capture rate were optimized.The results showed that quantity of enzyme，substrate concentration，hydrolysis time had a remarkable influence on the reaction and it was a positive correlation between the formaldehyde capture rate and amino nitrogen content.

gelatin；tyrisin enzyme；formaldehyde

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.006

2016-07-26

王嵬（1981—），男（汉），实验师，硕士，研究方向：食品质量与安全。

*通信作者