栀子苷与薯蓣皂苷对脑缺血再灌注大鼠急性期和恢复早期炎性损伤机制研究*

沈 甜,王 斌,李 敏,卫 昊,严亚峰,吕 腾,侯建平

陕西中医药大学(咸阳712046)

栀子苷与薯蓣皂苷对脑缺血再灌注大鼠急性期和恢复早期炎性损伤机制研究*

沈 甜,王 斌△,李 敏,卫 昊,严亚峰,吕 腾,侯建平

陕西中医药大学(咸阳712046)

目的：探索栀子苷与薯蓣皂苷对脑缺血大鼠再灌注损伤后的急性期和恢复早期炎性损伤的影响。方法：将大鼠分为假手术组、模型组(再灌注24 h和72 h)、给药组(栀子苷和薯蓣皂苷分别设置30 mg/kg、60 mg/kg组)和阳性药组(醒脑静10 ml/kg组 )并采用线栓法灌胃给药后造模，对脑缺血再灌注后的急性期(24 h)和恢复早期(72 h)大鼠整体行为学评估、脑组织海马区的形态学观察以及脑组织匀浆中炎症介质COX-2和5-LOX蛋白活力检测等指标进行检测观察。结果：栀子苷与薯蓣皂苷能显著提高神经损伤评分，降低脑内COX-2和5-LOX的活力。结论：栀子苷与薯蓣皂苷通过对花生四烯酸通路中COX-2和5-LOX蛋白活力的调节对大鼠脑缺血再灌注后急性期(24 h)和恢复早期(72h)的炎性损伤具有一定的治疗作用。

缺血性脑卒中已成为人类健康的头号杀手, 探索早期疾病发生发展的过程是疾病治疗和预后的关键。栀子苷是中药栀子的主要有效成分，对脑缺血再灌注损伤有保护作用，与黄芩苷配伍可减少炎性因子释放，抑制半胱氨酸白三烯受体表达，从而抗脑缺血炎性损伤[1]。薯蓣皂苷在穿龙薯蓣、黄山药薯蓣、盾叶薯蓣中含量丰富，具有抗血小板聚集和血栓形成作用，提示其具有脑保护作用。实验研究表明，栀子素和薯蓣皂苷配伍对脑缺血有保护作用[2]。本试验拟研究栀子苷与薯蓣皂苷对脑缺血再灌注大鼠急性期和恢复早期炎性损伤抑制机制，以期为脑缺血疾病的治疗提供参考价值。

材料与方法

1 试验药物 薯蓣皂苷批号110212(HPLC检测含量98%)；栀子苷，批号110831(HPLC 检测含量80%)，购于陕西中鑫生物技术有限公司。

2 试验动物 SD雄性大鼠 180 只，体质量 250～280 g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，合格证号SCXK(陕)2012-001。

3 试剂 COX-2试剂盒，批号：20130101A，5-LOX试剂盒，批号：20130101A，购自美国R&D公司；醒脑静注射液购自济民可信山禾有限公司，生产批号：Z32020863。

4 仪器 美国赛默飞Multiskan FC全自动酶标仪；北京科伟电热恒温水箱，HH.W21.420；直径为0.25 mm优质尼龙鱼线，产地为日本。

5 分组给药及造模 将雄性SD大鼠180只随机分为假手术组、模型组(脑缺血24 h再灌注24 h和72 h)，栀子苷60 mg/kg、30 mg/kg组，薯蓣皂苷60 mg/kg、30 mg/kg组，醒脑静10 ml/kg 组(24 h和72 h)，将药物用1%吐温溶液溶解，各组均按照0.50 ml/100g，1 次/d 的剂量连续灌胃给药4 d，假手术组和模型组给予等体积的1%吐温溶液作为阴性对照，末次给药30 min后，采用线栓法制备大脑中动脉局灶性脑缺血模型[4]。

6 指标检测及方法

6.1 行为学评分:该实验参照 Zea-Longa 五级评分法分别对大鼠脑缺血损伤后行为障碍程度进行评估建立MCAO脑缺血模型。

6.2 脑组织海马部位病理形态观察: 术后24 h，每组随机取3只大鼠，多聚甲醛灌注固定、取材、组织处理，进行苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察，拍照并进行评价。

6.3 脑组织 COX-2 和 5-LOX 酶活性检测: 造模后24h和72h，断头取手术侧大脑，用生理盐水制备10% 脑匀浆，置于-20℃ 冰箱冻存备用，Elisa试剂盒检测COX-2和5-LOX蛋白活力并进行BCA蛋白定量。

7 统计学方法 所有结果以均值 标准差表示，SPSS 17.0 统计学软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 表示具有显著性差异。

结 果

1 对神经功能缺损评分的影响 结果显示，与假手术组比较模型组(24 h和72 h)神经功能评分明显偏低，有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与模型组相比脑缺血再灌24 h，栀子苷60 mg/kg组、薯蓣皂苷60 mg/kg组有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与模型组相比脑缺血再灌72 h，薯蓣皂苷及栀子苷30 mg/kg组具有统计学意义(P<0.001)，结果见表1。

2 脑组织海马部位病理形态观察 假手术组大鼠海马CA1区脑组织结构完整排列有序，胞浆丰富染色清晰。与假手术组相比模型组大鼠脑部海马区呈现明显的水肿情况，组织出现空洞神经元稀疏排列散乱，进一步观察发现模型组海马区神经元细胞大量坏死、变性，胞核固缩深染、胞体皱缩，细胞间质疏松呈现筛状，神经元脱失、胶质细胞增生明显。给药组与模型组相比，正常神经元数量增多且排列规则，脑组织变性、坏死的范围也显著下降，结果见图1。

表1 治疗后大鼠急性期和恢复早期神经功能缺损评分的影响±s)

注：与模型组比*P<0.05，△P<0.01,▲P<0.001

假手术组 模型组 栀子苷60mg/kg组 薯蓣皂苷60mg/kg组 醒脑静10 ml/kg组

图1 MCAO大鼠脑组织海马区神经形态学观察(HE，400×)

3 脑组织COX-2活性 结果显示，模型组大鼠脑缺血再灌注24 h和72 h与假手术组比较，脑组织COX-2活性明显增强，有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，缺血再灌注24 h薯蓣皂苷60 mg/kg组和栀子苷60 mg/kg组脑组织中COX-2蛋白活性明显降低，有统计学意义(P<0.01)。脑缺血再灌72 h与模型组相比，栀子苷30 mg/kg组COX-2活性降低并具有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

4 脑组织5-LOX活性 结果显示，与假手术组，大鼠脑缺血再灌注24 h和72 h模型组脑组织5-LOX活性明显增强，具有统计学意义(P<0.05)。再灌注24 h时与模型组相比，薯蓣皂苷和栀子苷60mg/kg组5-LOX活性明显降低，具有统计学意义(P<0.01)。脑缺血再灌注72h与模型组比较，栀子苷30mg/kg组5-LOX活性降低并具有统计学意义(P<0.05),结果见表 3。

表 2 治疗后脑缺血大鼠急性期和恢复早期脑组织COX-2活性的影响±s)

注：与模型组比*P<0.05，∆P<0.01

表3 治疗后脑缺血大鼠急性期和恢复早期脑组织5-LOX活性的影响±s)

注：与模型组比*P<0.05,∆P<0.01

讨 论

缺血性脑卒中病机十分复杂，现代医学研究发现缺血性脑损伤与能量代谢衰竭、炎症损伤及钙超载等因素相关，而缺血/再灌注后诱发的炎症瀑布式级联反应对脑组织造成严重的二次损伤[3]。多种促炎因子、炎症介质共同参与调控体内复杂炎症级联反应网络，花生四烯酸代谢中COX-2和5-LOX两条通路参与该网络的调控[4]，生成的前列腺素类和白三烯类炎症介质可造成神经元损伤、凋亡，促进小胶质细胞(microglia)迁移和活化，随着5-LOX通路的激活其下游蛋白LTB4、CysLTs表达增加并与脑内半胱氨酰白三烯受体(CysLTR)结合诱导多种炎症病理过程的发生与发展从而加重脑部损伤[5]。

栀子苷是从茜草科植物栀子的主要活性成分，为环烯醚萜苷类化合物，异名京尼平苷，具有保护脑缺血损伤的作用。我们前期基于清热解毒治则，采用基线等比设计栀子黄芩不同配比，筛选出栀子黄芩配伍抗脑缺血炎性损伤的最佳配比(7∶3)，并且明显减少脑梗死面积和体积，改善脑缺血损伤。李等通过实验研究发现，栀子苷和黄芩苷按照一定比例组分配伍能够降低脑组织5-Lox的含量和表达，抑制5-Lox下游的半胱氨酸白三烯受体(CysLTR)和基因CysLTRmRNA在海马部位的表达；另有研究表明，黄芩素和薯蓣皂苷(1∶1)可减轻脑缺血小鼠神经损伤，减低脑梗死体积，调节细胞周期、信号传导、神经转录因子和蛋白结合等，因此我们推测栀子苷与薯蓣皂苷对脑缺血再灌注大鼠急性期和恢复早期炎性损伤有保护作用[6]。

本试验通过线栓法复制大鼠脑缺血再灌注模型[7]，研究发现，模型组大鼠脑缺血再灌注24h和72h均发生明显的神经行为学损伤，同时脑组织炎症介质COX-2、5-LOX高表达[8]；而薯蓣皂苷及栀子苷通过下调患鼠脑中蛋白的表达有效的改善了脑缺血/再灌注大鼠神经损伤和脑组织海马区神经病理形态学对脑缺血损伤具有一定的保护作用。

[1] 高龙潭, 王智勇, 吴俊霞, 等. 栀子苷对慢性脑缺血大鼠神经元凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响[J].江西中医学院学报2013,25(4):73-76.

[2] 王 斌,曹 慧,沈 甜,等.麝香、冰片对大鼠脑缺血-再灌注急性期和恢复早期炎性损伤的保护作用及机制研究[J].中药材,2015,38(10):2139-2143.

[3] 王 宁,李晓欧,巴晓红,等.远隔缺血后处理对脑缺血模型大鼠再灌注损伤炎性反应相关信号的影响[J].中国组织工程研究,2015,49(19):7902-7907.

[4] 陈义明, 余泽珍, 周 强, 等. 花生四烯酸细胞色素 P450 酶代谢通路基因多态性与脑梗死发病的相关性研究[J].浙江医学,2016,38(19):1553-1574.

[5] 李 敏,武 璞,吕 腾,等.醒脑静提取物对脑缺血再灌注炎性损伤5-LOX-CysLTs-CysLT 通路的影响[J].中药药理与临床,2015,31(6):131-134.

[6] 李 敏, 王 斌, 唐志书, 等. 黄芩苷、栀子苷对大鼠脑缺血保护作用的机制 [J] .中药药理与临床, 2012, 28(3): 34-36.

[7] 刘 波,李 菲,王 丽,等.改良线栓法制备SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型研究[J].现代医药卫生,2016,32(2):161-166.

[8] 甄毅岚,王亚男,李晟,等.线栓法制备不同体重 KM 小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的建立及评价[J].中国实验动物学报,2013,21(2):39-44.

(收稿：2016-10-15)

Investigate mechanism of Dioscin and Geniposide on inflammatory of cerebral ischemia and reperfusion injury at different time points of acute phase in rats

Shen Tian，Wang Bin，Li min，et al.

Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine(Xi’an 712046)

Objective：Exploration of Geniposide and Dioscin on cerebral ischemia reperfusion injury in rats after acute stage and recovery effect of early inflammatory injury. Methods：The rats were divided into 4 groups such as: sham group, model group , drug group and Xingnaojing 10ml/kg group. Copy ischemia-reperfusion model after administration of each drug, evaluate the score of nerve injury, determine COX-2 and 5-LOX activity in brain tissue. Results：Dioscin and Geniposide can improve the scores of nerve damage, reduce activity of COX-2 and 5-LOX in brain homogenates. Conclusion：Dioscin and Geniposide have protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in the acute phase through regulating the activity of COX-2 and 5-LOX protein in the four arachidonic acid pathway.

Dioscin Geniposide Inflammatory injury Animal，experiment Rats

*国家自然科学基金资助项目(81473385)

陕西省科技厅资助项目(2010K01-150)

陕西省教育厅资助项目(13JS029)

栀子苷 薯蓣皂苷 炎性损伤 动物，实验 大鼠

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.059

△通讯作者