加味黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠肠道菌群结构及IL-6/STAT3信号通路的影响*

王 倩，别玉龙，范文涛

陕西中医药大学(咸阳 712046)

·实验研究·

加味黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠肠道菌群结构及IL-6/STAT3信号通路的影响*

王 倩，别玉龙，范文涛△

陕西中医药大学(咸阳 712046)

目的：通过监测加味黄芩汤干预炎症性肠病大鼠模型肠道局部IL-6/STAT3信号通路的活性状态及大鼠肠道菌群改变情况，明确IL-6/STAT3信号通路与炎症性肠病肠道菌群平衡之间的关系。方法：将SPF级大鼠40只随机分成对照组、模型组、美沙拉嗪治疗组、加味黄芩汤治疗组、黄芩汤治疗组，每组8只。TNBS诱导结肠炎大鼠模型，分组进行药物干预。实验结束后取结肠组织做病理切片；放射免疫检测血清IL-6含量；酶联免疫分析法检测sIL-6Rα、gp130； RT-PCR方法检测STAT3、IL-6mRNA含量，采用日本光冈知足法并通过细菌三级鉴定法将细菌鉴定到属的水平。结果：加味黄芩汤治疗组大鼠进食量及排便情况，肠黏膜炎性病变程度，与模型组、美沙拉嗪治疗组比较具有显著差异(P<0.05)。在血清IL-6、血清sIL-6Rα、gp130含量， STAT3、IL-6mRNA的表达水平等方面，加味黄芩汤治疗组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。加味黄芩汤治疗组大鼠肠道菌群与对照组之间在属水平上存在统计学差异。结论：加味黄芩汤通过影响溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群失调状态，进而降低大鼠血清IL-6、sIL-6Rα、gp130含量，缓解sIL-6Rα与IL-6形成复合物所引起的炎症反应；进一步影响IL-6/ STAT3信号通路下调大鼠肠组织STAT3、IL-6 mRNA的表达水平，达到缓解肠道局部炎症的目的。

近年来有关炎症性肠病的研究发现患者肠道微生态平衡失调作用于遗传易感者，产生相关致炎因子并激活其免疫系统[1]，导致肠道局部免疫功能长期处于异常状态[2]，前期研究发现IL-6/STAT3信号通路在炎症性肠病发生发展中起着重要作用，虽然通过靶向阻断IL-6/STAT3信号通路治疗本病尚未完全攻破，但是在通过调控该信号通路活化状态缓解炎症性肠病临床症状，降低后期癌变风险方面仍具有重要价值[3]。既往实验证明黄芩汤在治疗炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)方面疗效较好，相关实验研究结果显示其中的有效成分黄芩苷、芍药苷和甘草酸对结肠炎患者肠道菌群失调状态有不同程度的改善作用[4]。对本病种传统中医特色药物信息整理后发现马齿苋在本病治疗过程中出现的频率较高，可能与其中活性有效成分的抑菌作用密切相关[5]。黄芩汤中加入马齿苋对TNBS诱导的炎症性肠病大鼠进行干预，验证加味黄芩汤是否能够通过对患者肠道菌群微生态失调状态的基础上对于IL6/STAT3信号通路进行调控。

材料与方法

1 动 物 SPF级SD大鼠40只(雌雄各半)，体重180±15g，购于西安交通大学实验动物中心，动物许可证编号为：SCXK(陕)2015-138。

2 主要试剂 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)，IL-6，STAT3，GP130试剂盒(R&D System)，RT(逆转录)试剂盒、黄芩汤按照原方比例黄芩9 g，芍药、甘草各6 g，大枣12枚(单个大枣重约6 g)，一剂黄芩汤生药量约85±2 g。加味黄芩汤中黄芩汤按照原方比例黄芩9 g，芍药、甘草各6 g，大枣12枚(单个大枣重约6 g)马齿苋参照药典正常人体用量换算为大鼠使用量，每剂约为15 g，美沙拉秦缓释颗粒剂(爱的发制药公司，批号04937)，细菌琼脂培养基(购自上海恒远生物科技有限公司)。

3 方 法

3.1 造模方法: 参照Morris[6]的方法制作TNBS诱导的结肠炎大鼠模型。对照组大鼠仅注入相同体积的0.9%氯化钠注射灌肠，其余条件均与TNBS组相同。

3.2 动物分组:正常饲养1周后，按完全随机方法将40只大鼠随机分为5组，分别为对照组(n=8)、TNBS模型组(TNBS，n=8)、TNBS+加味黄芩汤治疗组(Jiawei Huangqin Tang，JWHQT,n=8)TNBS+黄芩汤组对照(Huangqin Tang，HQT,n=8)和TNBS+美沙拉嗪治疗组(Mesalazine，n=8)组。

3.3 治疗:加味黄芩汤给予加味黄芩汤1.2 g/kg，每次10 ml/kg静脉注射，共持续1周；黄芩汤对照组给予黄芩汤1.2 g/kg，每次10 ml/kg静脉注射，共持续1周;美沙拉嗪组剂量为0.1 g/kg，每次10 ml/kg静脉注射,共持续1周;对照组及TNBS组大鼠均给予普通饮食饮水而不予治疗。

3.4 标本取材:治疗结束后，大鼠禁食24 h，麻醉后抽取腹主动脉血约5 ml，静置5 min后，离心，吸出血清，于-80℃冰箱保存。收集肠道内容物过滤去渣，滤液离心3000r/min，去上清液，置于-80℃冰箱保存备用。结肠组织用无菌滤纸吸干水分，每只大鼠取病变最明显处1cm左右3块，两块立即放入液氮中速冻，然后移至-80℃冰箱冷冻保存备用，一块在10%的福尔马林中充分固定，制作病理切片。

4 指标检测及方法

4.1 外观指标: 造模前后和给药前后分别观察大鼠精神及活动状况，记录饮食量及体重。

4.2 肠道菌群组成结构科水平测定: 待培养样品准备：称取清洗结肠组织内容物时收集的PBS洗脱液离心沉淀物10+3 g，备用。培养基的准备：根据日本冈知足法，选取以下十种菌作为肠道菌群代表并准备好相应选择性培养基，根据细菌生长对氧气的敏感性，其中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母菌四种菌落选择需养菌培养基，拟杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、消化球菌、真杆菌、小梭菌六种菌落选择厌氧菌培养基进行培养。细菌群落种类检测方法采用日本光冈知足法通过细菌三级鉴定法将细菌菌落情况鉴定到属的水平，检测下限为2×102CFU/g样品。所有菌落结果数据均相应取其对数值进行统计学分析。

4.3 病理学指标:大鼠结肠组织肉眼及病理学评分标准[3]，首先进行肉眼观察结肠表面溃疡及水肿情况，按照常规包埋、切片，厚度设定为为4μm，进行HE染色，高倍显微镜下选取合适视野，观察结肠组织形态。

4.4 血清中细胞因子测定: IL-6，TNF-α，STAT3用ELISA 试剂盒测定，严格按照试剂盒说明书进行。

4.5 免疫组化染色:采用S-P法检测各组大鼠结肠组织中的IL-6，GP130、及STAT3蛋白表达含量。

结 果

1 加味黄芩汤对IBD大鼠精神活动状况、饮食量及体重的影响 造模后，各组大鼠精神活动状况、饮食量及体重的影响， 各组大鼠精神活动状况、饮食量及体重均有不同程度升高，美沙拉嗪组、加味黄芩汤组、黄芩汤组升高均较明显，加味黄芩汤组与模型组比较(P<0.05)，加味黄芩汤组与美沙拉嗪组、黄芩汤组比较(P>0.05) ，见图1。

图1 加味黄芩汤对IBD大鼠体重的影响

2 加味黄芩汤对IBD大鼠肠道菌群组成结构属水平的影响 与空白对照组比较，加味黄芩汤组能升高肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌含量，降低酵母菌、拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、消化球菌含量，与空白组比较(P<0.05)，见表1。

3 病理学检测结果 空白组大鼠结肠组织结构正常，模型组大鼠肠组织纹理严重紊乱，美沙拉嗪组大鼠结肠组织结构部分紊乱，部分腺体遭到破坏，出现少量炎症细胞。加味黄芩汤组与黄芩汤组直肠组织出现较少的炎症细胞，组织水肿较轻，只有少量腺体破坏，部分黏膜表面糜烂，与模型组及美沙拉嗪组有显著差异，见图2。

表1 各组IBD大鼠肠道菌群组成结构属水平统计结果±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05

空白组 模型组 美沙拉嗪组 黄芩汤组 加味黄芩汤组

图2 各组病理HE染色结果

4 各组大鼠病理评分结果 加味黄芩汤能明显改善大鼠肠道病理变化及病理评分，与空白组比较(P<0.05)，与模型组比较(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较(P<0.05),见表2。

5 加味黄芩汤对IBD大鼠血清中IL6、TNF-α、PGE2含量的影响 加味黄芩汤能降低IL6、TNF-α、PGE2含量，与空白组比较(P<0.05)，与模型组比较(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较(P<0.05)。黄芩汤组与空白组比较(P<0.05)，与与模型组比较(P<0.05)，见表3。

6 加味黄芩汤对TNBS诱导的IBD大鼠结肠组织中IL-6mRNA、STAT3表达的影响 加味黄芩汤组与空白对照组、模型组、美沙拉嗪组比较(P<0.05)。加味黄芩汤能降低大鼠结肠组织中IL-6mRNA、STAT3表达量，与空白组比较(P<0.05)， 与模型组比较(P<0.05)。与美沙拉嗪组比较(P<0.05)。黄芩汤组与空白组比较(P<0.05)， 与模型组比较(P<0.05)，见表4。

表2 各组大鼠病理评分结果

注： 与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05与美沙拉嗪组比较▲P<0.05

表3 各组IBD大鼠血清中IL6、TNF-α、PGE2含量

注： 与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与美沙拉嗪组比较，▲P<0.05

表4 各组IBD大鼠结肠组织中IL-6mRNA、 STAT3表达量

注： 与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与美沙拉嗪组比较▲P<0.05

讨 论

目前基于IL-6/STAT3信号通路上的gp130抗体，抗IL-6单克隆抗体，STAT3反义寡核苷酸的使用对于该病的治疗效果明显[7]。随着近期对肠道内环境中菌群生长状态认识的不断深入发现IBD患者肠道菌群出现明显特征性异常变化，这与肠道局部免疫系统异常激活可能存在一定联系[8]。

传统中医药在治疗IBD方面有一定优势，尤其是被誉为“治痢祖方”黄芩汤在治疗IBD患者方面引起广泛关注，本实验所选方药加味黄芩汤是依据君臣佐使配伍理论在黄芩汤中加入马齿苋为臣药，辅助君药黄芩发挥清热燥湿的作用，佐以芍药、甘草发挥柔肝缓急止痛作用，生姜、大枣以调和胃气。近年来关于马齿苋的药理研究表明该药在调节胃肠道菌群失调方面有着独特的优势，其中含有的多种复杂成分在人体肠道微环境中起到综合性作用，一方面抑制条件致病菌增殖，另一方面其中富含的多糖成分具有调节人体免疫功能，并且其中所含的粘液质可以附着在受损肠壁表面起到暂时隔离保护作用[5]，这是其适用于IBD患者治疗过程中的独特优势。我们的实验结果证明了二者结合后肠道局部炎症损伤程度明显减轻，一些致炎因子释放明显减少，这说明炎症细胞功能状态趋向稳定，同时IL-6/STAT3信号通路状态明显下调。与此同时我们进一步观察到肠道菌群失调的情况较其他组明显恢复。这可能与其中配伍马齿苋增强其抗菌效应密切相关，已有实验证实IBD患者肠道菌群失调状态与IBD症状及病情恶化程度密切相关[9]，在我们试验中再次证实了这一理论。基于这一理论我们提出加味黄芩汤治疗IBD的药理效应可能是借助于存在于内环境中细菌这一载体实现的假说。但是由于存在于内环境中细菌群体的复杂性这一理论尚需进一步验证。

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[4] 陈建真,吕圭源,罗小敏,等. 黄芩汤分煎液与合煎液中黄芩苷、芍药苷和甘草酸含量的比较[J]. 中成药,2008,30(9):1330-1333.

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(收稿：2016-08-16)

Effects of Jiawei Huangqin decoction on the intestinal flora structure and IL6/STAT3 signal pathway in TNBS induced colitis in rats

Wang Qian, Bie Yulong, Fan Wentao.

Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Objective：Monitoring the active state of the local IL-6/STAT3 signal pathway in intestine of TNBS induced rats, to find the relationship between IL-6/STAT3 signaling pathway and inflammatory bowel disease.Methods:Rats up to the standard of SPF were randomly divided into normal control group,experimental control group, the salad lamictal treated group , Jiawei Huangqin treated group,Huangqin treated group,8 in each group. Induced by TNBS to make the colitis model, then every group intervention with difference drugs. After 28 days using cervical dislocation put everyone to death ,collected the colon contents, took the lesions tissue to pathological analyze,used Radioimmunoassay to detect the contents of serum IL-6, immunohistochemical staining method to detection of MPO, enzyme-linked immunoassay to detection sIL-6Rα, gp130,RT-PCR to detection content of STAT3、IL-6mRNA.Results：JiaWei HuangQin treated group’s intake,defecation and the degree of intestinal mucosa inflammatory lesions had differences compared with experimental control group and salad oxazine treated group.Conclusion: JiaWei Huangqin decoction would ease the bowel inflammation by lowering the content of IL-6,sIL-6Rα and gp130 content in rat’s serum, then regulated the activate state of IL-6/STAT3 signaling pathways to down-regulated the expression level STAT3, IL - 6 mRNA.

Colitis/traditional Chinese medicine therapy Jiawei Huangqin decoction Animal experimentation Rats

*国家自然科学基金资助项目(81202847)

结肠炎/中医药疗法 动物实验 大鼠 @肠道菌群结构 IL-6/STAT3

R516.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.058

陕西省教育厅项目(14JK1197)

陕西省中医药管理局项目(13-LC073)

△通讯作者