HPLC法测定白龙散中龙胆苦苷和小檗碱的含量

包爱情 ， 朱聪英 ， 陆春波 ， 林仙军

(浙江省兽药饲料监察所， 浙江杭州311101)

HPLC法测定白龙散中龙胆苦苷和小檗碱的含量

包爱情 ， 朱聪英 ， 陆春波 ， 林仙军

(浙江省兽药饲料监察所， 浙江杭州311101)

建立反向高效液相色谱法检测白龙散中龙胆苦苷和小檗碱含量的方法。试验采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，以0.5%三乙胺水溶液(用85%磷酸调pH值至3.0)-甲醇(60:40，v:v)为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长为270 nm；龙胆苦苷和小檗碱的含量测定范围分别为4.09～102.2 μg/mL(R=0.999 7)，3.93～98.26 μg/mL(R=1.000 0)；加样平均回收率分别为 98.63%，97.78%；RSD分别为0.96%，1.23%；该方法方便、准确、可靠，适用于测定白龙散中龙胆苦苷和小檗碱的含量。

白龙散； 高效液相色谱； 龙胆苦苷； 小檗碱

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，配Waters 2996二极管阵列检测器，美国Waters公司； XS-205电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料 甲醇为色谱纯，Merck 公司；其余试剂均为分析纯；试验用水为milli-Q 超纯水。龙胆苦苷对照品(来源：中国兽医药品监察所，批号：Z0250510，含量：100.0%)；盐酸小檗碱对照品(来源：中国兽医药品监察所，批号：110713—200911，含量：按小檗碱计为86.8%)。白龙散供试品(批号分别为20160101，20160102，20160103)，由浙江某厂生产；自制样品：中药饮片，购自上药凯仑医药股份有限公司；经浙江省兽药饲料监察所鉴定，按相应处方自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18XDB(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.5%三乙胺水溶液(用85%磷酸调pH值至3.0)-甲醇(60∶40)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：270 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取龙胆苦苷对照品10.22 mg和盐酸小檗碱对照品11.32 mg，置同一100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液(约为100 μg/mL)。精密量取20 mL混合对照品贮备液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。

2.2.2 供试品溶液 取白龙散0.1 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，精密加甲醇50 mL，称重，回流1 h，冷却至室温，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例分别自制不含龙胆和黄连的散剂，按其工艺制成相应的阴性对照样品，再按2.2.2方法制备成阴性对照溶液。

数据是计算机网络的重要组成部分，也是计算机网络的核心元素。在计算机网络运行的过程当中，数据会产生诸多漏洞，而不法分子则会利用这些数据漏洞来攻击计算机，致使计算机网络产生安全风险。如存在于计算机网络运行过程中的节点数据，其就极易遭到攻击，数据信息被窃取、篡改的现象时有发生，致数据完整性遭到破坏。部分不法分子还会在数据脆弱部分对其进行攻击，通过攻击此部分内容来窥探内网的数据信息，致内网数据遭到泄漏。此外，利用数据漏洞还可给计算机网络植入木马、病毒等，致系统瘫痪，无法运行。

2.3 系统适应性试验 分别取混合对照品溶液贮备液、混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液注入液相色谱仪，进行全波长扫描，记录龙胆苦苷和小檗碱的光谱图(图1～图2)；同时记录混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液的色谱图(图3～图6)。该色谱条件下，龙胆苦苷和小檗碱分离度良好，与其他峰分离良好，理论塔板数均大于3 000。阴性样品在混合对照品色谱图相应的位置上无吸收峰，表明处方中的其他成分对测定结果并无干扰，满足定量检测需要。注：图中峰1：龙胆苦苷；峰2：小檗碱。

图1 龙胆苦苷光谱图

图2 小檗碱光谱图

图3 混合对照品270 nm色谱图

图4 样品270 nm色谱图

图5 自制阴性样品(缺龙胆)270 nm色谱图

图6 自制阴性样品(缺小檗碱)270 nm色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 精密量取混合对照品贮备液(约100 μg/mL)适量，分别用甲醇稀释成约40、20、10、10、4 μg/mL系列溶液，分别精密量取上述混合对照品贮备液及相应稀释的溶液10 μL，按上述色谱条件，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积积分值(Y)对浓度(X，μg/mL)进行线性回归计算，方程为：

龙胆苦苷： Y=6219.4X-1868.8(R=0.999 7)，线性范围4.09～102.2 μg/mL;

小檗碱： Y=40,370.3X-16,246.4(R=1.000 0)，线性范围3.93～98.26 μg/mL。

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL,按上述色谱条件，连续重复进样6次记录峰面积，计算结果，龙胆苦苷和小檗碱峰面积的RSD分别为0.28%，0.32%。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：20160101)，分别在0、1、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL，记录色谱峰面积，计算龙胆苦苷和小檗碱的峰面积的RSD分别为1.01%、1.07%。结果表明，供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批供试品(批号：20160101)，分别称取6份，照2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定供试品溶液中龙胆苦苷和小檗碱的含量。结果测得龙胆苦苷的含量分别为25.86、25.72、25.70、25.93、25.49、25.74 mg/g；小檗碱的含量分别为8.44、8.76、8.66、8.56、8.52、8.69 mg/g；RSD分别为0.57%、1.38%。结果表明，此方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知龙胆苦苷和小檗碱含量的样品(批号：20160101) 0.05 g，共6份，置100 mL圆底烧瓶中，精密加对照品溶液(称取龙胆苦苷对照品13.26 mg和盐酸小檗碱对照品5.02 mg于同一500 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度)50 mL，其余按2.2.2项同法处理后，测定并计算回收率，结果见表1。

表1 白龙散回收率试验结果 (n=6)

2.5 样品测定 取不同批号的白龙散，按2.2.2项下方法处理，按上述色谱条件进行测定，计算样品中龙胆苦苷和小檗碱的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 (mg/g)n=3

3 讨论与小结

3.1 试验条件的优化

3.1.1 波长的优化 在波长选择上，通过二极管阵列检测器(PDA)在200 nm～400 nm进行了全扫描，结果显示，龙胆苦苷在275 nm的波长处有最大吸收，小檗碱在228、265、347 nm的波长处有较大吸收波长，在270 nm的波长处，两者均有较大的吸收，因此本文将检测波长定为270 nm。

3.1.2 提取方式的优化 在提取方式选择上，比较了浸渍、超声和回流的提取效果，研究表明，对龙胆苦苷的提取上浸渍没有超声和回流效果好，但超声和回流没有差异；但在小檗碱的提取上回流要优于超声，超声又要明显优于浸渍，因此为了更好地提取本文选择回流作为提取方式。

3.1.3 提取时间的优化 在提取时间的选择上，比较了30 min，60 min和90 min的提取效果，研究表明，对于龙胆苦苷3种时间无显著差异，而对于小檗碱30 min的提取效果要显著低于60 min和90 min，而60 min和90 min的提取效果相当，因此本试验将提取时间定为60 min。

3.2 小结 本试验参考文献[5-6]选用不同的比例的甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸为流动相进行梯度洗脱，结果表明，选用当前试验的流动相时，样品中龙胆苦苷和小檗碱分离效果好、无杂峰干扰且时间短。目前尚未见到白龙散组分含量测定相关文献报道，文献报道[7-8]小檗碱含量测定的方法普遍在流动相配制中使用了十二烷基磺酸钠，而十二烷基磺酸钠对C18柱有一定的破坏性，本试验使用的流动相对柱子伤害较小。本试验开发的方法单针分析时间短，前处理简便，方法简便可靠，可用于大批量样品检测进行，可为白龙散质量控制提供参考。

[3] Lei Zhaoa, Juan Yea, Guo-tai Wu,etal. Gentiopicroside prevents interleukin-1 beta induced inflammation response in rat articular chondrocyte [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2015,172: 100-107.

[4] Guo-xun Lia, Xi-mo Wanga, Tao Jiang,etal. Berberine prevents damage to the intestinal mucosal barrier during early phase of sepsis in rat through mechanisms independent of the NOD-like receptors signaling pathway [J]. European Journal of Pharmacology, 2014,730: 1-7.

[5] 王文月，刘志宏，黄爱文，等. 双波长HPLC法测定酸性龙胆合剂中龙胆苦苷和橙皮苷的含量[J]. 中国药房, 2015,26(9):1241-1243.

[6] 陈静，支张， 索朗次仁，等. HPLC法测定藏药解吉那保不同部位龙胆苦苷的含量[J]. 现代中医药, 2015, 35(6): 92-94.

[7] 熊巨良. 高效液相色谱法测定五味黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量[J]. 湖南中医杂志, 2014, 30(9): 152-154.

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Determination of Gentiopicroside and Berberine in Bailong San by HPLC

BAO Ai-qing , ZHU Cong-ying , LU Chun-bo ， LIN Xian-jun

(Zhejiang Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff, Hangzhou 311101，China)

To establish a HPLC method for the determination of gentiopicroside and berberine in Bailong San, analysis was performed on a C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm)with a mobile phase of 0.5% triethylamine in water(pH was adjusted to 3.0 by 85% phosphoric acid)-methanol (60:40，v:v)at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30℃. The injection volume was 10 μL and the determination wave length was 270 nm. The linear range was 4.09～102.2 mg/mL(r=1.000 0) and 3.93～98.26 mg/mL (r=1.000 0), and the average recovery was 98.63% and 97.78% with RSD% of .96% and 1.23%, respectively. This method was convenient, accurate and reliable for the determination of gentiopicroside and berberine in Bailong San .

Bailong San; HPLC; Gentiopicroside; Berberine

2016-08-05

包爱情(1989—)，男，硕士，从事兽药检测、畜产品兽药残留检测工作，E-mail：baoaiqing@126.com

R286

A

0529-6005(2017)03-0096-03