水解酪素对藏系绵羊瘤胃液体外产气及纤维素分解率的试验研究

田发益 ， 巴 平

(西藏农牧学院生物技术中心 ， 西藏 林芝 860000)

水解酪素对藏系绵羊瘤胃液体外产气及纤维素分解率的试验研究

田发益 ， 巴 平

(西藏农牧学院生物技术中心 ， 西藏 林芝 860000)

反刍动物瘤胃中生产甲烷和纤维素分解两类微生物对环境和家畜起着重要的作用。生产甲烷不仅消耗养分，同时也是温室气体的主要来源；纤维素分解菌提供反刍家畜主要的碳水化合物。提高纤维素分解菌的活力是本研究的重点之一，同时掌握对甲烷产气菌的影响程度。通过瘤胃胃管抽取藏系绵羊的瘤胃液，采用体外产气装置进行产气量测定；通过瘤胃液中放置无纺织纤维袋以测定纤维素消失率；采用厌氧培养进行瘤胃细菌菌落记数的方法进行测定分析。结果表明，添加一定量的水解酪素后，体外产气量增加22.35%，P=0.433，差异不显著；对总纤维素25.8%的消失率进行t检验，试验组和对照组组间P=0.043，差异显著，总纤维素消失率增加3.5%。试验结果说明，添加水解酪素具有明显提高纤维素分解菌的活力，负效应是甲烷产气量也适当增加。

藏系绵羊 ； 瘤胃液 ； 体外产气 ； 纤维素消化率 ； 水解酪素

牛羊瘤胃中的微生物不仅影响瘤胃发酵的效率，同时也是反刍家畜蛋白质的来源之一。在瘤胃微生物中，82%的微生物可以利用氨作为惟一的氮源而合成蛋白，25%的微生物在没有氨的状态下不能生长，56%的微生物既可以利用氨也可以利用氨基酸作为氮源而合成蛋白质[1]。微生物对氨基酸的利用具有选择性，部分氨基酸难以被细菌利用，而瘤胃微生物对某些氨基酸具有优先选择利用的可能性。

甲烷是最简单的有机物，牛羊嗳气排出的甲烷气是重要的温室气体排放源之一。政府间气候变化专门委员会(IPCC)第四次评估报告指出，甲烷已成为全球第二大温室气体[2]，反刍动物瘤胃甲烷排放占自然界甲烷排放量的13%～19%[3]。

牛羊在西藏的经济生活中占有相当重要的位置，据2015年统计，西藏2015年羊存栏数为1 190万头(只)，其中绵羊存栏数为749万只，山羊存栏数为441万只[3]。由此可以估算，西藏反刍家畜每天喛气产生的甲烷气约为2.2×106m3/天。瘤胃在发酵过程中生成甲烷降低了消化能到代谢能的转化率，能量损失占饲料总能的2%～15%。减少家畜体内甲烷的生成不仅可以提高动物的生产性能，而且对控制温室效应有一定作用。本试验的目的是使用混合的瘤胃细菌并在无气源存在的条件下进行体外培养发酵试验，确定不同的物质在培养基里刺激瘤胃细菌生长和产气的效果。通过试验，选择最佳的饲料配比，提高西藏反刍家畜的消化率。

1 材料与方法

1.1 试验动物 2015年8月，项目组选择饲养的4只成年藏系绵羊，粗饲草为天然牧草，每只羊每天补饲0.2 Kg玉米粉(内含0.1%的CaHPO4和适量的盐)。1.2 取样 瘤胃液的取样采用瘤胃胃管法，胃管直径1 cm的硅胶半透明管，取样前胃管外壁涂石碏油，一端直插入羊瘤胃中，一端通入缓冲瓶底部中，缓冲瓶的上部再接入溶剂过滤器(WR-2001型，上海嘉鹏科技有限公司产品)的抽气端，使缓冲瓶中形成负压。如出现胃管堵塞，使用反冲法冲开堵塞部位。每次瘤胃液的取样不少于200 mL，之后装满于200 mL的三解瓶，使之排完所有空气，密封盖口(以防瘤胃微生物与O2气长时间接触而死亡)，速送实验室进行测试分析。1.3 试验方法 采用体外人工唾液法，为了降低试验误差，每只羊瘤胃液均采用试验组和对照组进行比对，试验前用两层纱布过虑瘤胃液，各取滤液50 mL，再加入50 mL配制人工唾液进行试验。1.3.1 人工唾液配制 A液为过滤瘤胃液(用两层纱布即可)。微量元素B溶液：每100 mL蒸馏水中溶解CaCl2·2H2O(13.2 g)、MnCl2·4H2O(10.0 g)、CoCl2·6H2O(1.0 g)、FeCl2·6H2O(0.8 g)。缓冲液(C)的配置：NaHCO3(35 g)、NH4HCO3(4 g)。调节pH值为7.0～7.3。常量元素(D)：Na2HPO4(5.7 g)、KH2PO4(6.2 g)、MgSO4(0.6 g)。刃天青溶液(E)：0.1%(100 mg刃天青加蒸馏水至100 mL)，厌氧指示剂，煮沸时有游离氧存在时为红色，无氧时呈无色。还原剂溶液(F)：Na2S·9H2O(672 mg)。

瘤胃微生物培养液配置比例：Menke培养液：400 mL蒸馏水+0.1 mL溶液A+200 mL缓冲液+200 ml常量元素+1.0 ml刃天青溶液+40.0 ml还原剂溶液混匀。混合培养液∶瘤胃液=1∶1。1.3.2 无编织纤维袋法测定纤维素的消化率 试验组：每50 ml瘤胃液中添加一定量青稞秸秆(装在特制无编织纤维素袋中，用于测定纤维素消化率)，放入瘤胃液中。试验组瘤胃液中加0.2 g水解酪素。对照组：青稞秸秆装入特制无编织纤维素袋中，用于测定纤维素消化率。

1.3.3 体外产气及消化试验设置 试验者发明的人工体外瘤胃液产气装置(专利号：ZL 2015 2 0838055.X)。

1.3.4 瘤胃细菌培养基 采用改良分离瘤胃细菌培养基[5]。

1.3.5 纤维含量的测定 采用范氏(Van soest)滤袋法测定无纺织袋中各分类纤维素的含量。

2 结果

2.1 体外不同时间、不同添加剂产气量对照试验 试验过程中，准确记录时间，每隔2 h记录一次产气量，直至完整记录24 h。24 h后从人工瘤胃液中取出无纺织纤维袋，37 ℃水温搓洗3～4次，再用无水丙酮搓洗2～3次，用来测定青稞秸秆消失率及其他剩余NDF、ADF、ADL等纤维素的消失率。产气结果见表1、图1、图2。

表1 添加水解酪素对体外瘤胃液产气累积量的影响 (mL/50 mL)

图1 添加水解酪素对体外瘤胃液单位时内产气量的影响(mL/50 mL·2 h)

图2 添加水解酪素对体外瘤胃液累积产气量的影响(mL/50 mL·2 h)

羊的瘤胃体积约20 L左右，每天产气约50 L，即2.4 L甲烷气/天·L瘤胃液。对表1中数据采用两组样本均数比较的(组内和组间)t检验(SPSS 23)，对照组组内P=0.638，差异不显著；试验组组内P=0.680，差异不显著；试验组和对照组组间P=0.433，差异不显著。瘤胃中产甲烷微生物与其他微生物之间存在相互依存和共生的关系，尽管试验组与对照组差异不显著，但添加水解酪素后，产气量明显增加，通过瘤胃细菌培养基进行48 h培养，可见菌落总数对照组为1.43 CFU±0.16×106，试验组为1.57CFU±0.35×106，根据试验结果计算，产气量每增加1倍，细菌总数增加0.4倍。试验组甲烷产气量增加22.35%，说明水解酪素对甲烷生成菌的活力具有一定的促进作用2.2 水解酪素体外人工唾液法对纤维素消化率的影响 纤维素分解采用西藏常见青稞秸秆，也是西藏农牧区常用的家畜粗饲草。尽管产气量与纤维素的消化率没有直接关系，但试验中发现，甲烷产气菌活性的增加，也对纤维素分解菌的活力具有一定的促进作用，可提高纤维素的分解效率，试验结果见表2。

表2 体外瘤胃液添加水解酪素对纤维素消化率的试验

对试验组和对照组组间剩余各纤维含量通过两组样本均数的t检验，P=0.936，差异不显著；但对总纤维素25.8%的消失率进行t检验，试验组和对照组组间P=0.043，差异显著。添加水解酪素的试验组对纤维素的分解率提高了3.5%，而增加的这部分纤维素以中性洗涤纤维为主，达3.5%。这一结果说明，添加水解酪素对反刍动物纤维素分解菌的活力和增殖具有一定的促进作用。

3 讨论

本试验通过体外瘤胃液添加水解酪素，可提高纤维素分解菌及产甲烷菌的增殖和活力，较显著地提高纤维素的分解。

3.1 体外人工唾液产气量的分析 目前，已对21个属的70种产甲烷菌已经从厌氧环境中分离鉴定，但是到目前为止，只有7种瘤胃产甲烷菌被分离纯化[6-7]。在反当动物瘤胃内，产甲烷菌主要依靠氢营养型产甲烷菌通过氧化H2，还原C02生成CH4。瘤胃中82%的甲烷由H2和CO2的还原反应生成[8]。瘤胃产甲烷菌游离在瘤胃内或与瘤胃原虫形成共生体[9]，同时产甲烷菌还与真菌形成共生体[10]。研究表明，产甲烷菌的数量和活性也受日粮的影响，饲喂高精料日粮的羊和牛的瘤胃液中分别含有产甲烷菌107/g～108个/g和108/g～109个/g，放牧的羊和牛的瘤胃液中含有产甲烷菌109/g～1010个/g[11]，同时放牧动物的产甲烷菌多样性高于圏养的反刍动物。抑制甲烷产气菌，提高纤维素分解菌的活力是畜牧业研究的理想，但瘤胃菌群之间的相互依存关系特别复杂，到目前为止还没有取得好的应用成果。

酪蛋白水解后(水解酪素)，富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全。一般情况下，饲草中部分氨基酸含量缺乏和不足是正常现象。通过添加适量的混合氨基酸，可激活或增强瘤胃内各类微生物的活性及增殖能力。在试验中，几种氨基酸组合，不能有效地刺激瘤胃细菌的生长，只有添加混合氨基酸才能明显地促进瘤胃细菌的生长，甲烷产气量明显增加，增加量为22.35%。

3.2 体外人工唾液纤维素消失率的分析 添加水解酪素有利于提高瘤胃中纤维素利用菌的活性。根据试验结果，可提高纤维素3.5119%的分解力，体外瘤胃液中菌落总数也相应增加了0.4倍。试验说明瘤胃内纤维素分解菌主要以分解半纤维素和部分纤维素为主，试验组NDF消失率提高了3.5%。

反刍家畜瘤胃中的微环境是一长期进化，各微生物之间相互协同利用，又相互制约的动态环境。研究结果说明，添加水解酪素有利于瘤胃微生物的增殖，提高饲草纤维素的分解效率。

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Research on Cellulose-decomposing andMethanogenesisin Vitro within Rumen Fluid of Tibetan Sheep by AddedHydrolyzedCasein

TIAN Fa-yi, BA Ping

(Biology and Technique center of Tibet Agriculture and Animal Husbandry College , Nyingchi 860000 ， China)

Two kinds of microorganisms play an important in cellulose-decomposing and on rumen fermentation andmethanogenesisfor animals and environment.The reaction process of methane gas is not only nutrients consuming but also the primary source of greenhouse gases.The main carbohydrate of rumens is provided by cellulose decomposition bacteria.One key point of this paper is to study the activity of cellulose decomposition bacteria.The methane gas productioninvitrowas measured by the gas device in rumens fluid extracted from Tibetan sheep through a rumen tube.The disappearance rate of cellulose was analyzed by no textile fiber bags within rumen fluid,the bacterial colony within rumen fluid was counted by anaerobic culture.The results showed that the methane gas production had increased 22.35% with addition of a certain amount of hydrolyzed casein,Differences were no significant before and after the added hydrolyzed casein (p=0.433),and the total disappearance rate of cellulose was 25.8% a significant 3.5% increase(p=0.043).The results prove that addition of hydrolyzed casein enhances the vitality of cellulose-decomposing.However,the methane gas production is also increased.

Tibet sheep ; Rumen fluid ;Methanogenesisin Vitro ; Disappearance rate of cellulose ;Hydrolyzedcasein

2016-05-04

国家自然科学基金(31360557)

田发益(1967-)，男，教授，硕士，主要研究西藏动物生产和植物活性成分等工作，E-mail:xztfy@163.com

S816.79

A

0529-6005(2017)03-0047-03