2015年河南省规模化奶牛场BHV-1感染情况调查

皇甫和平 ， 朱志超 ， 石冬梅 ， 王 岩 ， 宋予震，陈 益 ， 王 军 ， 许文博 ， 王林康 ， 史静柯 ， 李聪聪 ， 潘昊纯

(1．河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南郑州450046 ； 2．河南农业大学牧医工程学院 ， 河南郑州450002)

2015年河南省规模化奶牛场BHV-1感染情况调查

皇甫和平1， 朱志超2， 石冬梅1， 王 岩1， 宋予震1，陈 益1， 王 军1， 许文博1， 王林康1， 史静柯1， 李聪聪1， 潘昊纯1

(1．河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南郑州450046 ； 2．河南农业大学牧医工程学院 ， 河南郑州450002)

为了解河南省规模化奶牛场牛疱疹病毒1型(BHV-1)的感染情况，课题组于2015年2～8月，对河南省5个地区的12个规模化奶牛场进行了分层随机抽样，共采集了440头牛的鼻腔和/或阴道拭子样品，采用qPCR方法进行BHV-1的病原学检测。结果：共检测出阳性奶牛68头，总体阳性率为15.45%；场阳性率为100%，其中阳性率最高场达到了68.00%，最低场为6.67%；5个地区的阳性率由低到高依次为豫东(10.00%)、郑州地区(10.78%)、豫北(12.04%)、豫西(20.00%)、豫南(35.82%)；不同年龄段奶牛的阳性率不同，犊牛、后备青年牛、1胎、2胎、3胎、4胎以上牛分别是3.57%、6.67%、23.53%、26.22%、14.55%、28.57%；患病牛阳性率为28.13%，明显高于外观健康牛的13.23%。结果表明，2015年河南省调查的5个地区普遍有BHV-1感染，其中豫西、豫南地区的阳性率较高，明显高于豫东、豫中和豫北地区；随着奶牛年龄和胎次的增加，阳性率整体呈上升趋势；BHV-1感染与奶牛的临床健康状况密切相关，其中患有乳房炎牛群的阳性率最高。本试验首次利用qPCR对河南省规模化奶牛场进行了较为系统的BHV-1病原学调查，直接揭示了牛群中BHV-1的感染情况，分析了BHV-1感染与奶牛的年龄、机体健康状况、牛场地理环境等的关系。

河南省 ； 牛传染性鼻气管炎 ； qPCR ； 感染情况

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛疱疹病毒I型(BHV-1)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，以鼻气管炎、高热、流产、眼结膜炎、传染性脓疱性外阴阴道炎为主要特征。BHV-1具有潜伏感染和长期带毒的特点，并具有泛嗜性，可侵害多个组织器官，对奶牛产奶量、繁殖力等均有较大的影响。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病。

国内多个省市均有IBR的存在[1]，课题组在2010年进行了河南省奶牛IBR的血清流行病学调查，24个奶牛场均有IBR存在，538头奶牛的总阳性率为59.29%[2]。前期研究采用的是ELISA方法检测BHV-1抗体，能判断牛体内是否感染了BHV-1，但无法判断牛体内BHV-1是否处于活跃状态。荧光定量PCR方法相比以往的病毒分离鉴定、普通PCR等方法，敏感性要高很多，而且省时、省力，能够更加真实地反映出BHV-1在牛群的流行感染情况。

为直接从病原学层面揭示BHV-1在本省规模化牛场的流行情况，本试验首次运用Taq-Man荧光定量PCR方法，对河南省的规模化牛场进行了BHV-1的病原学检测，以期客观评价BHV-1在牛群中的感染程度。

1 材料与方法

1.1 样品 2015年2～8月期间，在河南省5个地区(豫东、豫西、豫南、豫北及郑州地区)的12个规模化奶牛场进行了分层随机抽样，共采集了440头牛的鼻腔和/或阴道拭子样品，-80 ℃冻存待检。

1.2 BHV-1 qPCR引物及探针 参照蒋珊珊的方法[3]，设计针对BHV-1gE基因序列的特异性引物和探针(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段为75 bp。

表1 qPCR引物和探针

1.3 主要试剂及仪器 AceQ®qPCR Probe Master Mix(Vazyme)、Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；900系列超低温冰箱由赛默飞世尔仪器公司生产；ABI7500实时荧光定量PCR仪由美国应用生物系统公司生产。

1.4 方法

1.4.1 拭子的处理 将采集的棉拭子分别放入1.5 mL EP管，加入1 mL的生理盐水，振荡30 s，室温浸泡20 min或4 ℃过夜待处理。

1.4.2 拭子病毒DNA的提取 按照Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒操作步骤提取棉拭子中病毒DNA。

1.4.3 qPCR检测方法 反应体系：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，荧光探针(10 μmol/h)0.5 μL，上下游引物(10 μmol/h)各0.4 μL，模板1 μL，加dH2O至25 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.4.4 临床样品的检测 以含部分gE基因片段的重组质粒为阳性对照，对440头牛的棉拭子DNA进行qPCR检测。

1.4.5 统计方法 运用SPSS19.0软件对不同地区的阳性率数据进行差异性统计分析。

2 结果

2.1 牛拭子样品检测结果 12个牛场均检出BHV-1阳性，场阳性率为100%，其中阳性率最高场达到了68.00%，最低场为6.67%，440头牛共检出阳性68头，总阳性率达到15.45%。5个地区的阳性率由低到高依次为豫东地区(10.00%)、郑州地区(10.78%)、豫北地区(12.04%)、豫西地区(20.00%)、豫南地区(35.82%)。豫南和豫东地区(P<0.01)、豫南和豫北地区(P<0.01)、豫南和郑州地区(P<0.01)的结果差异极显著；其他地区结果间存在的差异不显著(P>0.05)。见表2、中插彩版图1、图2。

2.2 不同年龄、胎次牛的拭子检测结果 不同年龄、胎次牛的拭子检测结果见表3、图3。阳性率最低的为犊牛，结果为3.57%，最高的为4胎以上奶牛，结果是28.57%。

2.3 不同健康状况奶牛的拭子阳性率 不同临床健康状况奶牛的阳性率见表4。由表4可知，患病牛群的阳性率总体为28.13%，远高于外观健康牛群的13.23%。患乳房炎牛的检出率最高，结果是47.37%，其次为繁殖障碍牛群的24.14%、外观消瘦、拉稀牛的14.29%和呼吸道疾病牛的11.11%。

3 讨论

抽检的12个奶牛场均为BHV-1阳性，场阳性率为100%，440头抽检牛的总阳性率为15.45%。

表2 不同牛场BHV-1阳性率

表3 不同年龄阶段牛的拭子阳性率

图3 不同年龄阶段牛的拭子阳性率

表4 不同健康状况牛的拭子阳性率

所有调查牛场均未防疫过IBR疫苗，说明河南省奶牛场仍广泛存在BHV-1感染。相比较于过去常用的检测抗体的血清学方法，本试验利用qPCR方法检测BHV-1核酸，直接揭示BHV-1在牛体内的感染情况，能更加真实地反映牛体内处于活跃状态病毒的感染情况。

不同地区奶牛场BHV-1的阳性率差异明显，由低到高依次为豫东、郑州地区、豫北、豫西、豫南地区，其中豫西和豫南地区的阳性率均高于总体阳性率，课题组在2010年进行调查也发现豫西和豫南地区的阳性率较高[2]。通过PearsonX2分析结果显示，豫南和豫东地区(P<0.01)、豫南和豫北地区(P<0.01)、豫南和郑州地区(P<0.01) 的结果差异极显著。河南省不同地区IBR阳性率的差异可能与不同地区的自然地理位置有一定关系，如豫西、豫南山区较多，而郑州和豫东地区以平原为主，这一情况与王永艳调查结果相似，其发现山区的BHV-1抗体阳性率显著高于丘陵和平原地区[4]。

结果发现，不同年龄及胎次牛均为BHV-1阳性，并且随着年龄和胎次的增加，阳性率整体呈上升的趋势，表明奶牛BHV-1感染与牛的年龄和胎次有一定的相关性，随着牛龄和胎次的增加，奶牛感染BHV-1的几率也随之增加。

患病牛群明显高于外观健康牛的阳性率，其中患乳房炎的牛群中，BHV-1的阳性率最高，结果为47.37%(9/19)，其次为繁殖障碍牛群的24.14%、外观消瘦、拉稀牛的14.29%、呼吸道疾病牛的11.11%，上述结果表明，BHV-1感染与多种临床病症有关，但BHV-1感染与这些患牛病症间的具体因果关系仍不清楚，这一情况或许与乌兰其其格等报道的BHV-1感染后能够导致牛的非特异性免疫能力下降有关[5]。但呼吸道疾病牛群中的阳性率仅为11.11%，与预期相反，推测与样品数量少有关，需要对更多数量的样品进行检测来研究。

在当前奶牛养殖业转型升级的关键阶段，疾病是制约奶牛养殖业效益的重要因素。本研究从病原学角度证实了河南省奶牛场BHV-1的普遍感染，并分析了河南省不同地区BHV-1的流行情况、BHV-1 感染与牛群年龄、健康状况等的关系，提醒人们应加强对IBR的重视，积极做好IBR的防控。

[1] 邹世颖, 何倩妮，刘蕾, 等. 中国北方六省市牛传染性鼻气管炎病流行病学分析[J]. 中国兽医杂志, 2012,48(2): 47-48.

[2] 石冬梅, 王岩, 张华, 等. 河南省奶牛传染性鼻气管炎血清学调查[J]. 畜牧与兽医,2011,43(6):67-68.

[3] 蒋姗姗，赵莎莎，狄和双，等. 牛传染性鼻气管炎病毒的荧光PCR检测方法[J]. 江苏农业科学，2013，41(1)：45-47.

[4] 王永艳, 王仲兵, 郑明学, 等. 山西省雁门关地区牛传染性鼻气管炎感染情况与相关因素的调查[J]. 中国畜牧兽医, 2010,37(6):194-197.

[5] 乌兰其其格，高晶，周伟光，等. BHV-1对牛单核巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响[J].畜牧与饲料科学，2015.36(4)：23-25.

An Investigation on BHV-1 Infection in Large-Scale Dairy Farms in Henan Province in 2015

HUANG FU-heping1, ZHU Zhi-chao2, SHI Dong-mei1, WANG Yan1, SONG Yu-zhen1, CHEN Yi1, WANG Jun1, XU Wen-bo1, WANG Lin-kang1, SHI Jing-ke1, LI Cong-cong1, PAN Hao-chun1

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China; 2.Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to study the BHV-1 infection status in large-scale dairy farms in Henan province, we conducted stratified random sampling on 12 large-scale dairy farms in 5 regions across Henan province. Nasal and/or vaginal swab samples were collected from a total of 440 cows for etiological detection of BHV-1 using qPCR. Results: A total of 68 cows were tested positive for BHV-1, accounting for the total positive rate15.45%. A total positive rate was 100% in the 12 ranch, and their positive rate was in the range of 68.00% to 6.67% in specific farms. The positive rate in specific regions was, in ascending order, 10.00% in East Henan, 10.78% in Zhengzhou, 12.04% in North Henan, 20.00% in West Henan, and 35.82% in South Henan. The positive rate varied in cows in different age groups, which was 3.57%,6.67%,23.53%,26.22%,14.55% and 28.57% in calves, reserve young cows, cows with 1 parity, cows with 2 parities, cows with 3 parities and cows with 4 or more parities, respectively. The positive rate was 28.13% in diseased cows, which was significantly higher than that in healthy cows, which was 13.23%. The results suggest that BHV-1 infection is prevalent in all of the 5 regions in Henan province in 2015, with the positive rate significantly higher in West Henan and South Henan than that in East Henan, Zhengzhou and North Henan. The positive rate presents a tendency toward rising with increasing age; BHV-1 infection is closely related to the clinical health of cows, and the positive rate is the highest in cows with mammitis. This study for the first time used qPCR for systemic etiological investigation on BHV-1, revealed the actual BHV-1 infection status in cows; and addressed the association between BHV-1 infection and animal age, health and geological environment of dairy farm.

Henan Province; Infectious bovine rhinotracheitis; qPCR; Infection status Corresponding author：SHI Dong-mei

2016-08-16

河南省重大科技攻关计划项目(132102110053)；河南省教育厅科技攻关计划项目(14B230006)；河南牧业经济学院科技创新团队(HUAHE2015004)

皇甫和平(1977-)，男，讲师，博士，主要从事动物疾病发病机理研究，E-mail:hepinghf@163.com

石冬梅,E-mail: dongmeishi126@126.com

S858.23

A

0529-6005(2017)03-0010-03