miR-34b在老年鼻咽癌组织中表达及对细胞增殖、侵袭的影响

钟 玲

(中航工业成都363医院，四川 成都 610041)

miR-34b在老年鼻咽癌组织中表达及对细胞增殖、侵袭的影响

钟 玲

(中航工业成都363医院，四川 成都 610041)

目的 探讨miR-34b在老年鼻咽癌组织中表达及对细胞增殖、侵袭的影响。方法 选取初治原发性老年鼻咽癌患者83例，正常鼻咽黏膜组织40例作为对照组，培养人鼻咽癌CNE-2细胞株，根据转染物不同将细胞分为miR-34b转染组、阴性对照组和空白对照组，利用实时荧光定量PCR技术检测老年鼻咽癌及对照组组织中miR-34b表达以及不同转染组细胞中miR-34b表达，MTT比色法检测不同转染组细胞增殖能力，检测细胞黏附能力，Transwell法检测不同转染组细胞侵袭能力。结果 老年鼻咽癌组织中miR-34b相对表达量为(0.64±0.09)，显著低于对照组的(0.94±0.12)，差异有统计学意义(t=14.410，P<0.001)；miR-34b在老年鼻咽癌组织中相对表达量与临床分期、T分期、N分期和淋巴结转移有关(P<0.001)；miR-34b转染组细胞中miR-34b相对表达量为(0.85±0.10)，显著高于阴性对照组和空白对照组，分别为(0.52±0.08)和(0.50±0.07)，差异有统计学意义(F=243.329，P<0.001)；与阴性对照组和空白对照组相比，miR-34b转染组细胞增殖能力显著降低(P<0.05)；miR-34b转染组黏附细胞数显著高于阴性对照组和空白对照组，而侵袭细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.001)。结论 miR-34b在老年鼻咽癌组织中呈低表达，上调miR-34b表达可减少细胞增殖，增加细胞黏附能力，抑制细胞侵袭能力，有望成为提高鼻咽癌对放射治疗敏感性的目的基因。

鼻咽癌；miR-34b；细胞增殖；侵袭能力

鼻咽癌作为我国头颈部常见恶性肿瘤，好发于中老年人群，随着我国人口老龄化加剧，老年鼻咽癌患病率不断上升〔1〕。由于鼻咽癌发病位置隐匿、早期缺乏典型临床症状，加之老年人群各项机体功能下降，往往合并多种慢性病，多数患者确诊时已处于晚期，严重影响患者预后〔2〕。关于鼻咽癌发生机制尚未完全清楚，饮食、环境和EB病毒感染等多种因素都可能诱发鼻咽癌〔3〕。微小RNA(miRNA)作为广泛存在于生物体内的高度保守的短小RNA，在调控多项生理和病理过程中发挥重要作用，miRNA表达异常与人类多种肿瘤发生密切相关〔4〕。miR-34b作为miR-34家族重要成员，在多种恶性肿瘤发生及进展中发挥重要作用〔5〕。本研究拟对miR-34b在老年鼻咽癌患者组织中表达进行分析，并通过转染miR-34b处理，观察其对人鼻咽癌CNE-2细胞株增殖、黏附及侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年3月至2015年4月在成都363医院治疗的初治原发性老年鼻咽癌患者83例，其中，男61例，女22例，年龄65～85〔平均(71.3±7.6)〕岁，均经病理学检查确诊，均为非角化未分化癌，均未接受放化疗治疗。临床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期26例，Ⅲ期29例，Ⅳ期27例；T分期：T1+T2期44例，T3+T4期39例；N分期：N0+N1期57例，N2+N3期26例。选取正常鼻咽黏膜组织40例作为对照组，年龄65～86〔平均(70.4±7.2)〕岁，男27例，女13例，两组患者性别、年龄等一般情况差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和设备 Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Biomiga公司，逆转录试剂盒、PCR试剂盒和LipofectamineTM2000转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司，miR-34b、内参U6、miR-34b模拟物及阴性对照序列均由上海生工公司设计合成，人鼻咽癌CNE-2细胞株由美国ATCC提供，RPMI 1640培养基、胎牛血清(BSA)和G418试剂均购自美国Sigma公司，噻唑蓝法(MTT)细胞增殖/毒性检测试剂盒购自南京森贝伽生物公司，Transwell小室购自美国Corning公司，人源纤维连接蛋白(Fn)购自美国Sigma公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 利用实时荧光定量PCR技术检测老年鼻咽癌及对照组组织中miR-34b表达 取老年鼻咽癌及对照组组织，研磨后，加入细胞裂解液裂解，用Trizol总RNA提取试剂盒对组织中总RNA进行提取，利用紫外分光光度计对总RNA纯度进行检测，取A260/A280≥1.80作为合格样品。将总RNA逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。引物序列分别为：miR-34b：上游：5′-CAATCACTAACTCCACTGCC-3′；U6：上游：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′，二者通用下游引物序列为：5′-AACATGTACAGTCCATGGATG-3′。PCR反应条件：95℃ 60 s，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，连续进行38个循环，每个样品均设三个平行反应复孔。以U6为参照，用2-△△Ct法获得老年鼻咽癌及对照组组织中miR-34b相对表达量。

1.3.2 细胞培养及处理 将人鼻咽癌CNE-2细胞株培养于含10% BSA的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2条件下恒温培养，稳定传代后，取对数生长期细胞，按5×104/孔接种于6孔板中继续培养至细胞融合度达到70%～80%。将细胞分为三组，利用LipofectamineTM2000转染试剂盒对各组进行转染：miR-34b转染组：转染miR-34b模拟序列：正义链：5′-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3′，反义链：5′-GGCAGUGGAGUUAGUG AUUGUU-3′；阴性对照组：转染阴性对照序列：正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3′；空白对照组：不做任何处理。转染后各组细胞继续进行培养。

1.3.3 利用实时荧光定量PCR技术检测不同转染组细胞中miR-34b表达 取各组转染后培养48 h细胞，加入细胞裂解液进行裂解，其余方法同1.3.1。

1.3.4 MTT比色法检测不同转染组细胞增殖能力 取各转染组细胞，接种于96孔板中，调整细胞密度为5×104/孔，每组均设置6个平行反应复孔，分别于转染后24 h、48 h、72 h和96 h，将MTT液20 μl加入各孔，继续培养4 h，将二甲基亚砜150 μl加入各孔，振荡15 min，结晶充分溶解后，利用酶标仪对570 nm处光密度值(OD值)进行检测。

1.3.5 细胞黏附能力检测 将Fn稀释液50 μl包被96孔板，于培养箱中处理120 min。将1% BSA 100 μl加入各孔，封闭120 min。取各组转染后培养48 h细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为5×104/ml，加入各孔，于培养箱中培养60 min。将96孔板取出后，用甲醛固定15 min，用吉姆萨进行染色15 min。显微镜下观察，随机取5个视野，对黏附细胞进行计数。

1.3.6 Transwell法检测不同转染组细胞侵袭能力 取各组转染后培养48 h细胞，胰酶消化后，调整细胞密度为5×104/ml。将50 μl Matrigel胶铺于24孔板Transwell小室，培养箱中过夜。去200 μl细胞悬液加入小室上室，将培养液加入小室下室，于37℃恒温培养箱中培养12 h，取出小室，将上室中的细胞轻轻擦去，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次后，用结晶紫染色15 min。用显微镜进行观察，随机取5个视野，计数细胞数。

2 结 果

2.1 老年鼻咽癌及对照组组织中miR-34b表达比较 老年鼻咽癌组织中miR-34b相对表达量为(0.64±0.09)，显著低于对照组的(0.94±0.12，t=14.410，P<0.001)。

2.2 miR-34b在老年鼻咽癌组织中表达与临床病理特征之间的关系 miR-34b在老年鼻咽癌组织中相对表达量与年龄、性别无关(P>0.05)，而与临床分期、T分期、N分期和淋巴结转移有关(P<0.001)。见表1。

2.3 不同转染组细胞中miR-34b表达比较 miR-34b转染组细胞中miR-34b相对表达量为(0.85±0.10)，显著高于阴性对照组和空白对照组，分别为(0.52±0.08)和(0.50±0.07)，差异有统计学意义(F=243.329，P<0.001)。

2.4 不同转染组细胞增殖能力比较 根据不同转染组细胞不同时点OD值，绘制细胞不同时点生长曲线，分析发现，与阴性对照组和空白对照组相比，miR-34b转染组细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。见图1。

2.5 不同转染组细胞黏附能力和侵袭能力比较 miR-34b转染组黏附细胞数显著高于阴性对照组和空白对照组，而侵袭细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.001)。见表2，图2，图3。

指标nmiR-34b相对表达量t值P值年龄(岁)1.0070.158≥72500.62±0.07<72330.65±0.10性别0.0730.471男610.63±0.08女220.66±0.11临床分期14.280<0.001Ⅰ+Ⅱ期270.71±0.08Ⅲ+Ⅳ期560.49±0.06T分期17.113<0.001T1+T2期440.81±0.14T3+T4期390.39±0.06N分期15.846<0.001N0+N1期570.77±0.10N2+N3期260.43±0.09淋巴结转移16.101<0.001是470.41±0.07否360.78±0.12

图1 不同转染组细胞增殖能力比较

组别黏附细胞数侵袭细胞数miR-34b转染组183.5±21.71)2)135.4±29.51)2)阴性对照组102.3±15.9218.6±33.9空白对照组107.6±16.8223.4±38.2F值350.063114.816P值<0.001<0.001

与空白对照组比较，1)P<0.05；与阴性对照组比较：2)P<0.05

图2 不同转染组细胞黏附能力比较

图3 不同转染组细胞侵袭能力比较

3 讨 论

老年鼻咽癌发病率不断增加，且受老年人机体生理功能下降的影响，多数患者确诊时已处于中晚期，放疗成为主要的治疗手段，而放疗近远期效果与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭力等密切相关〔6〕。miRNA是一类长度约为20～25个核苷酸的非编码小RNA，可通过结合于靶基因mRNA的3′非翻译区而降解mRNA或抑制蛋白翻译，从而实现在转录后水平上对基因表达的调控，与细胞增殖、分化及凋亡、器官形成、免疫反应等多种生物学过程密切相关〔7〕。研究表明，肿瘤发生及进展过程涉及多种miRNA表达异常。miR-34b作为miR-34家族重要成员，受P53直接转录调控，在抑制肿瘤增殖、分化中发挥重要作用〔8〕。在对多种恶性肿瘤研究时发现〔9〕，miR-34基因启动子区甲基化导致miR-34表达下调甚至缺失，可使细胞周期及细胞凋亡失调，从而导致肿瘤发生。曹岚等〔10〕研究发现，miR-34b启动子区CpG岛甲基化使白血病细胞株中miR-34b表达降低，而外源性导入miR-34b可抑制细胞增殖、转移及侵袭能力。本研究显示，miR-34b可能参与了老年鼻咽癌发生及进展过程，且在该过程中可能发挥抑癌基因的功能。

该研究结果说明，利用转染miR-34b模拟物的方式可以上调CNE-2细胞中miR-34b表达，抑制CNE-2细胞增殖，进一步提示miR-34b可能在鼻咽癌发生中发挥抑癌基因功能〔11〕；上调miR-34b还可增加细胞黏附能力，而降低细胞侵袭能力，提示miR-34b可能在鼻咽癌发生、进展过程中发挥重要作用。

综上，miR-34b在老年鼻咽癌组织中呈低表达，上调miR-34b表达可减少细胞增殖，增加细胞黏附能力，抑制细胞侵袭能力，有望成为提高鼻咽癌对放射治疗敏感性的目的基因。

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7 Schmitz U,Naderi-Meshkin H,Gupta SK,etal.The RNA world in the 21st century-a systems approach to finding non-coding keys to clinical questions〔J〕.Brief Bioinform,2016;17(3):380-92.

8 郑 瑛,李有杰,王萍玉,等.顺铂对LT EP-a-2细胞中miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响〔J〕.滨州医学院学报,2016;39(2):81-4.

9 Li XJ,Ren ZJ,Tang JH.MicroRNA-34a:a potential therapeutic target in human cancer〔J〕.Cell Death Dis,2014;5(7):e1327.

10 曹 岚,王 娜,潘 健,等.miR-34b甲基化在白血病细胞增殖中的影响〔J〕.中华儿科杂志,2014;52(11):840-5.

11 Yang C,Ma X,Liu D,etal.Promoter polymorphisms of miR-34b/c are associated with risk of gastric cancer in a Chinese population〔J〕.Tumour Biol,2014;35(12):12545-54.

〔2016-12-09修回〕

(编辑 袁左鸣)

四川省卫计委基本医学科研项目(No.110103)

钟 玲(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事耳鼻喉疾病诊断与治疗研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1668-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.043