回药扎里奴思方对大脑中动脉闭塞模型大鼠白细胞介素-6、-2含量的影响

甘佳乐 刘敬霞 黑长春 刘 超 刘抒雯

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

回药扎里奴思方对大脑中动脉闭塞模型大鼠白细胞介素-6、-2含量的影响

甘佳乐 刘敬霞 黑长春 刘 超 刘抒雯

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

目的 探讨回药扎里奴思方对脑缺血急性期再灌注损伤后大鼠脑内白细胞介素(IL)-6和IL-2含量的影响。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、扎里奴思方组，除假手术组外其余各组均采用线栓法大脑中动脉闭塞(MCAO)复制脑缺血再灌注模型，用HE染色观察脑组织形态学改变，用酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫组化法测定各组大鼠脑组织中IL-6和IL-2的表达，并对各组进行神经功能评分。结果 假手术组脑内有少量IL-6和IL-2；脑缺血再灌注后IL-6和IL-2的表达开始上升，IL-6在3 d时达到高峰；与模型组比较，尼莫地平组与扎里奴思方组均能显著降低大鼠神经功能评分，改善再灌注损伤后大鼠脑组织病理形态，减少IL-6和IL-2的表达(P<0.05)；在7 d时，扎里奴思方的作用较尼莫地平显著(P<0.05)。结论 扎里奴思方可明显抑制大鼠急性期脑缺血再灌注损伤后脑组织中IL-6和IL-2的含量，且与用药时间呈正相关，这可能是其脑保护作用机制之一。

脑缺血；白细胞介素-6；白细胞介素-2

回族医药在防治脑系疾病方面具有完善的理论体系和独特的治疗方药。扎里奴思方出自《回回药方》残卷12“众风门”〔1〕，原文记载其具有“取脑中浊物风痰和开中风神昏窍闭”的作用，用于治疗中风“半身不遂、口眼歪斜”〔2〕等症。团队前期的研究表明，扎里奴思方可改善缺血半暗带血流，下调神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平，调节血脑屏障，抑制血小板黏附和聚集，调节血脂代谢及氧自由基〔3～7〕。本实验以大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)的方法建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型，检测再灌注损伤后大鼠脑内的白细胞介素(IL)-6和IL-2含量，以期进一步探讨扎里奴思方治疗脑缺血疾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠150只，SPF级，3～4月龄，体重约(300±50)g，由宁夏医科大学动物实验中心提供，动物合格证号2013-0001。所有大鼠在同一房间中饲养，房间温度控制在(25±1)℃，湿度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由进食和饮水，适应性饲养1 w后开始实验。

1.2 药物及主要仪器 扎里奴思方(出自《回回药方》)组成：安息香3 g，干祖伐即怀牛膝24 g，法里公即茴香12 g，兀沙吉即乳香12 g，法忒刺撒里荣即当归12 g，木里叶即没药12 g，撒法郎即番红花12 g，芦荟12 g，伯思八牙即水龙骨12 g，腽肭脐即海狗肾12 g，阿夫忒蒙即菟丝子12 g，石菖蒲12 g，肉桂12 g，牡丹皮12 g，由宁夏医科大学附属回医中医医院制剂室提供，方中所用生药材按组方剂量配比，煎煮过滤后浓缩至含生药3.0 g/ml，4℃保存备用，用前稀释至生药材含量1.5 g/ml；尼莫地平片(拜耳医药保健有限公司提供，30 mg/片，批号：H20003010)，用蒸馏水配成(1.08 g/L)混悬液。兔抗鼠IL-6抗体，兔抗鼠IL-2抗体，羊抗兔IgG及免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自北京诚林生物技术有限公司，水合氯醛、多聚甲醛购自天津市元立化工有限公司，双氧水购自兰州润康爱医疗保健品有限公司。显微镜：日本奥林巴斯；石蜡切片机：德国莱卡RM2015。

1.3 分组与给药 SD大鼠按随机数字表法分为假手术组10只，模型组、尼莫地平组、扎里奴思方组1、3、7 d每个时间点各15只。所有动物于造模清醒后2 h按相应分组灌胃给药，给药剂量按动物与人体表面积折算：扎里奴思方1.5 g/ml、尼莫地平1.08 mg/ml，模型组和假手术组以生理盐水代替，1次/d。

1.4 动物模型的制备 采用改进的线栓法制备MCAO模型。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后大鼠仰卧固定于手术板，颈前正中切开，分离左侧颈总、颈内及颈外动脉，颈总近端及远心端挂线，于颈总动脉分叉处剪一约0.2 mm小口，缓慢将栓线穿入经小口由颈总进入颈内，直到感觉轻微阻力，进线长度18～20 mm，确定无出血后缝合皮肤。2 h后稍抽出栓线使局部血流恢复。MCAO模型制作成功的标准为大鼠苏醒后表现为提尾离地时右前肢内收屈曲；在地板爬行时向右侧划圈；站立时向右侧倾倒。假手术组只分离颈总、颈内外动脉，不穿入栓线。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃，室温(26.0±1)℃。

1.5 神经功能评分 大鼠清醒后进行Zea-Longa评分。0分为无神经功能缺损症状，正常进食、饮水；1分为将尾巴提起后右前肢屈曲；2分为向右侧转圈；3分为向右侧倾倒；4分为右侧偏瘫，不能自发行走，意识丧失。评分≥2分表明模型成功，<2分则予以排除。各组动物于处死前2 h进行评分。

1.6 取材及标本处理 造模成功的大鼠按不同时间点用10%水合氯醛麻醉后，于冰盘上迅速断头取脑，取左侧大脑，用电子秤称重后放入玻璃匀浆器，加入10倍于脑组织重量的生理盐水匀浆，将匀浆3 000 r/min，15 min离心后取上清置4℃冰箱待测。另一半大鼠用4%多聚甲醛于心尖灌注固定，取出大脑常规脱水，石蜡包埋后用冰冻切片机冠状连续切片，片厚5 μm，分别进行HE染色病理观察及免疫组化检测。

1.7 指标检测 采用双抗体夹心ELISA检测大脑匀浆中IL-6与IL-2含量。严格按照试剂盒说明书进行操作。免疫组化采用SABC法，AEC显色，切片脱蜡后放入1%甲醇双氧水，室温10 min，蒸馏水洗1次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液在微波炉内微波辐射10 min；待修复液降至室温后，PBS洗3次×5 min；切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。切片上滴加一抗IL-6浓度为1∶150，IL-2浓度为1∶300，4℃过夜，PBS洗3次×5 min。滴加生物素化二抗(IgG)，37℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；DAB显色，充分水洗；苏木素复染，常规乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。PBS代替一抗作为对照。显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色，每只大鼠取海马部位切片5张，置于400倍物镜下，每张切片随机选5个不同视野，用多功能真彩色细胞图像分析管理系统计数阳性细胞，取平均值。HE染色后，光镜下观察大鼠海马CA1区神经元的形态学变化。

1.8 统计学处理 用SPSS19.0 统计软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 扎里奴思方对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响 用药后1、3、7 d，扎里奴思方组与尼莫地平组神经功能评分均显著低于模型组(P<0.05)。扎里奴思方组与尼莫地平组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组3 d、7 d与1 d比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

组别1d3d7d假手术组-0.00±0.00-模型组2.67±1.213.00±0.891.83±0.75尼莫地平组1.67±0.511)1.50±0.541)2)1.33±0.511)2)扎里奴思方组1.5±0.541)1.17±0.401)2)1.05±0.331)2)

与模型组比较：1)P<0.05；与1 d组比较：2)P<0.05

图1 扎里奴思方对大鼠缺血脑组织病理学改变的影响(HE，×400)

2.2 扎里奴思方对脑缺血再灌注大鼠脑组织形态学的影响 见图1。HE染色结果显示，术后7 d假手术组海马组织结构排列整齐，胞体、核仁清晰，染色均匀，神经元细胞排列紧密。模型组海马组织细胞排列紊乱，结构松散，间质内可见大小不等的空泡，部分神经细胞核固缩、深染，无核仁，神经元细胞减少，呈现凋亡特征，细胞皱缩，界限不清；大部分细胞有退行性改变，神经细胞呈嗜酸性。扎里奴思方组和尼莫地平组神经细胞排列略紊乱，仍可见细胞固缩，其周边可见神经细胞轻度肿胀，胞质、胞膜、胞核尚能分清，程度较模型组明显减轻，扎里奴思方组较尼莫地平组改善明显。

2.3 扎里奴思方对脑缺血再灌注大鼠IL-6及IL-2阳性细胞数的影响 脑缺血1 d，IL-6及IL-2阳性细胞数即开始增加，IL-6在3 d达高峰，7 d有所下降。模型组IL-6及IL-2阳性细胞数与假手术组比较差异显著(P<0.05)；扎里奴思方组各时间点与模型组比较差异显著(P<0.05)，IL-6阳性细胞数与尼莫地平组比较在1、3 d差异显著，IL-2阳性细胞数扎里奴思方组明显低于尼莫地平组(P<0.05)。见表2，图2，图3。

组别IL-61d3d7dIL-21d3d7d假手术组8.6±0.56.2±1.15.3±0.69.7±1.58.3±1.27.4±1.8模型组29.6±1.51)36.3±3.81)28.3±4.11)37.6±1.41)34.3±1.51)32.6±2.51)尼莫地平组26.0±3.01)2)23.7±1.51)2)18.3±2.51)2)33.8±2.61)2)27.6±1.41)2)24.4±2.61)2)扎里奴思方组18.0±2.01)2)3)15.8±2.31)2)3)14.3±1.51)2)22.7±2.51)2)3)21.8±3.31)2)3)17.6±2.51)2)3)

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与尼莫地平组比较：3)P<0.05

图2 各组大鼠海马CA1区神经元IL-2表达(DAB，×400)

图3 各组大鼠海马CA1区神经元IL-6表达(DAB，×400)

2.4 扎里奴思方对缺血再灌注不同时间点大鼠脑组织中IL-6含量的影响 与假手术组比较，模型组1、3、7 d后脑组织中IL-6含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方可降低缺血再灌注1、3、7 d IL-6的水平(P<0.01)。尼莫地平组和扎里奴思方组IL-6含量随着缺血再灌注后时间的延长而逐渐下降，扎里奴思方组下降更为明显(P<0.05)，见表3。

2.5 扎里奴思方对缺血再灌注不同时间点大鼠脑组织中IL-2含量的影响 IL-2在假手术组中含量最低(P<0.01)；与模型组比较，尼莫地平组、扎里奴思方组可显著降低缺血再灌注1、3、7 d组IL-2水平(P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方组的IL-2含量均降低(P<0.05)，其中7 d组降低更为明显(P<0.01)，见表3。

组别IL-61d3d7dIL-21d3d7d假手术组66.48±6.4973.23±2.3370.51±3.36149.82±15.68150.02±6.09135.62±2.32模型组200.65±3.811)215.47±4.581)212.40±6.591)448.06±4.451)485.46±7.921)486.84±9.471)尼莫地平组174.5±14.132)172.62±4.392)163.45±2.092)399.5±11.321)2)368.80±7.681)2)357.1±11.481)2)扎里奴思方组108.76±7.432)3)103.43±6.542)3)85.87±5.592)3)252.7±10.631)2)3)200.52±9.981)2)3)175.18±9.151)2)3)4)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与尼莫地平组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤后大脑会产生一系列病理变化包括自由基生成增多，神经细胞凋亡，Ca2+失衡，炎症反应等。IL-6是一种双糖蛋白链组成的多肽，具有广泛的生物活性，参与人体多种重要病理生理活动，在机体的炎症反应中发挥着重要作用。正常情况下，IL-6在脑组织的表达量较少，脑缺血后IL-6可通过A2b受体的作用使其表达量显著增加。研究发现IL-6在炎症反应的早期能诱导大量白细胞聚集和其他炎性因子的释放，从而引起“炎症瀑布”样反应，加重脑损伤〔8〕。Loddick等〔9〕和Legos等〔10〕在对脑缺血大鼠的研究中发现IL-6在病侧脑缺血组织中含量增加，明显多于对侧正常脑组织，缺血后24 h达到高峰。Wilan等〔11〕研究表明，脑脊液与血清中的IL-6是脑梗死的独立危险因子，且脑梗死体积越大，血清中IL-6水平越高。IL-2是CD+T淋巴细胞中的Th1细胞产生的一种淋巴因子，IL-2不仅可以刺激活化T细胞分泌淋巴因子，参与机体的免疫调节作用，而且可以增强T淋巴细胞、单核细胞的细胞毒性。研究发现IL-2可抑制降钙素基因相关肽(CGRP)的合成和释放，而CGRP能拮抗ET 从而引起脑血流量的减少〔12〕。因此，IL-2是缺血性脑卒中发生发展过程的关键因素之一。朱士文等〔13〕的研究也表明脑血管病急性期IL-2与血脑屏障的损伤有关。李琪〔14〕在研究中也发现脑梗死急性期外周血中IL-6、IL-2的含量比正常人明显升高，这也与本实验结果一致。所以，减少或抑制IL-6、IL-2的生成对减轻脑缺血再灌注损伤具有重要的研究意义。

扎里奴思方由具有芳香开窍的安息香、茴香、乳香、没药、石菖蒲，具有补肾益髓的海狗肾、怀牛膝、菟丝子，具有活血化痰的红花、当归、芦荟等药物组成，与中风急性期风、痰、瘀的病理特点正好相符，且对于恢复期及后遗症期气虚血瘀、肝肾阴虚的本虚标实之证亦有一定的功效。本研究表明，扎里奴思方可抑制但不能阻断IL-6、IL-2的产生，其具体机制还需进一步研究。扎里奴思方在缺血再灌注过程中的脑保护作用可能是通过降低脑组织中IL-6及IL-2的含量来实现的。

1 冯彩琴，贾孟辉，贺晓慧，等.《回回药方》防治脑系疾病的剂型及用药规律探析〔J〕.宁夏医科大学学报〔J〕.2011；33(2)：103-4.

2 宋 岘.《回回药方》考释12卷〔M〕.北京：中华书局出版社，2007：1607.

3 李 娟，刘敬霞，吴 鹏，等.扎里奴思方对急性脑梗死患者血清NSE水平的影响〔J〕.时珍国医国药，2014；25(7)：1750-1.

4 李 娟，吴 鹏，刘敬霞，等.扎里奴思方对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠P-糖蛋白的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(5)：1319-21.

5 刘抒雯，刘敬霞，刘 超，等.扎里奴思方对痰瘀互结型脑缺血再灌注大鼠血液流变学、血脂及自由基代谢的影响〔J〕.广州中医药大学学报，2015；32(5)；884-974.

6 刘敬霞，李建生，牛 阳，等.扎里奴思方和蜜煎菖蒲方对脑缺血大鼠血栓形成和血小板聚集的影响〔J〕.宁夏医科大学学报，2011；33(12)：1117-9.

7 刘敬霞，李建生，牛 阳，等.扎里奴思方和蜜煎菖蒲方对脑缺血大鼠神经元损伤的影响〔J〕.宁夏医科大学学报，2011；33(11)：1001-3.

8 王 渊，方思羽，张苏明.白细胞介素与脑缺血〔J〕.临床神经病学杂志，2000；13(3)：189-90.

9 Loddick SA，Turntboll AV，Rothwell NJ，etal.Cerebral interleukin-6 is neuroprotective during permanent focal cerebral ischemia in the rat〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，1998；18(2)：176-9.

10 Legos JJ，Whit more RG，Erhardt JA，etal.Quantitative changes in interleukin in proteins following focal stroke in the rat〔J〕.Neurosci Lett，2000；282(3)：189-92.

11 Wilan N，Castillo J，Dowalos A，etal.Proinflammatory cytokines and neurological worsening in ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000；31(10)：2325-9.

12 盛树力，张万江，伍 洁，等.降钙素基因相关肽对脑血管和脑血流量的影响〔J〕.首都医学院学报，1990；11(14)：259-65.

13 朱士文，王立才，李义召.急性脑血管病患者血清和脑脊液肿瘤坏死因子、白介素及免疫球蛋白水平与免疫功能关系的临床研究〔J〕.中国中西医结合急救杂志，2002；9(1)：41-3.

14 李 琪.血清白介素IL-2、IL-6及IL-8与急性脑梗死关系探讨〔J〕.中国误诊学杂志，2009；9(18)：4304-5.

〔2016-10-13修回〕

(编辑 李相军)

Effect of Hui medicine Zhali Nusi Fang on IL-6 and IL-2 in MCAO rats

GAN Jia-Le, LIU Jing-Xia, HEI Chang-Chun,etal.

Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the Hui medicine Zhali Nusi Fang on acute cerebral ischemia reperfusion of rat brain IL-6 and IL-2 after injury.Methods SD rats were randomized into sham, model, nimodipine, Zhali Nusi Fang groups.Except the sham group, rats in the other groups were used thread occlusion (MCAO) to duplicate the cerebral ischemia reperfusion model.Morphological changes of brain tissue were observed by HE staining, enzyme linked immuno-labeling assay (ELISA) and immunohistochemistry were used to determine the expressions of IL-6 and IL-2 in the brain tissue of rats, neurological score of rat was detected.Results In sham group, there were few expressions of IL-2 and IL-6 in the brain, the expressions of IL-2 and IL-6 began to rise after cerebral ischemia reperfusion, IL-6 reached the peak at day 3.Compared with model group, nimodipine and Zhali Nusi Fang could significantly reduce rat neural function score, improve brain tissue pathological changes after ischemia reperfusion injury, reduce the expressions of IL-2 and IL-6(P<0.05); at day 7, the effect of Zhali Nusi Fang was significantly more obvious than that of nimodipine(P<0.05).Conclusions IL-6 and IL-2 in the brain of rats with acute cerebral ischemia reperfusion injury could be obviously inhibited by Zhali Nusi Fang and it is positively correlated with the time of administration, which may be one of the mechanisms of cerebral protection.

Cerebral ischemia;IL-6;IL-2

“十二五”国家科技支撑计划“病证结合”(SQ2013SF12E02181)

刘敬霞(1970-)，女，博士后，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事中医药防治老年病研究。

甘佳乐(1990-)，女，在读硕士，主要从事中医药防治老年病研究

R743

A

1005-9202(2017)07-1576-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.006