葡萄籽原花青素对胆汁酸盐在结肠腺细胞Caco-2中转运的影响Δ

来丽华，葛 建（1.杭州市中医院广兴堂国医馆中药房，杭州 310007；2.中国计量大学药学系，杭州310018）

葡萄籽原花青素对胆汁酸盐在结肠腺细胞Caco-2中转运的影响Δ

来丽华1＊，葛 建2#（1.杭州市中医院广兴堂国医馆中药房，杭州 310007；2.中国计量大学药学系，杭州310018）

目的：研究葡萄籽原花青素（GSP）对甘氨胆酸钠（GA）和牛磺胆酸钠（TA）在结肠腺细胞Caco-2中跨膜转运的影响。方法：利用Caco-2细胞模型，采用反相-高效液相色谱法测定细胞培养液中GA和TA的含量。试验分为GSP组、GA组、TA组、GSP+ GA组和GSP+TA组，分别检测0、2、4、8 h从Transwell小室顶端（AP）侧透过Caco-2细胞向基底端（BL）侧转运GA和TA的透过量。结果：GA和TA检测浓度的线性范围均为0.05～1.2 mmol/L（R2＝0.999 9）。随着时间的延长，GA组和TA组BL侧GA和TA的透过量急剧增加；而加入GSP后，BL侧GA和TA的透过量明显较少，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：GSP对GA和TA在Caco-2细胞中的跨膜转运具有抑制作用。

葡萄籽原花青素；结肠腺细胞Caco-2；牛磺胆酸钠；甘氨胆酸钠；跨膜转运

原花色素是广泛存在于多种植物中，具有C6-C3-C6基本构架的一类多酚化合物的总称，其中原花青素报道最多，分布最为广泛。国内外研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌以及保护肝和心脑血管系统等作用[1-3]。近年来，关于葡萄籽原花青素（GSP）在调控心脑血管系统功能方面的报道较多，尤其是GSP对机体脂质代谢过程改善方面的报道最多[4]。然而，关于GSP调控脂质代谢的分子机制研究报道较少。

胆汁酸是在肝中由胆固醇合成的物质，与甘氨酸或牛磺酸结合生成甘氨胆酸钠（GA）或牛磺胆酸钠（TA）分泌入十二指肠，胆汁酸盐可在盲肠末端被重吸收进入肠肝循环，以保持胆汁酸盐的动态平衡[5]。有研究表明，部分水果、蔬菜或茶叶中某些组分可结合胆汁酸盐，使其排出体外，阻止胆汁酸盐的重吸收，可促进血浆及肝中胆固醇转化为胆汁酸，从而降低胆固醇的含量，起到降血脂的效果[6-7]。

笔者前期研究表明，儿茶素类天然多酚化合物能显著吸附胆汁酸盐，从而抑制肠道脂质吸收，起到调控血脂代谢功能[8]。而GSP为儿茶素的天然聚合物，同样能显著吸附或结合胆汁酸盐。本文主要研究GSP对胆汁酸盐GA和TA在结肠腺细胞Caco-2中跨膜转运的影响，旨在揭示其在调节脂质代谢方面的可能机制。

1 材料

1.1 仪器

LC-20ATvp高效液相色谱（HPLC）系统和Prominence SPD-20A紫外检测器（日本Shimaduz公司）；CB53 CO2细胞培养箱（德国Binder公司）；24孔培养板用Transwell小室（美国Corning公司）；TS100-F倒置显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 药品与试剂

GSP原料药（宁波禾普生物科技有限公司，批号：20101012，纯度：＞95%）；TA标准品（批号：C1319058，纯度：95%）和GA标准品（批号：D1303029，纯度：98%）均购于杭州邦易化工有限公司；苯酚红（批号：P110947，纯度：＞99%）和二甲基亚砜（批号：D103281，纯度：＞99.9%）均购于上海阿拉丁有限公司。

1.3 细胞与培养液

结肠腺细胞Caco-2购于中国科学院上海细胞典藏中心，用DMEM细胞培养液（含1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、100 u/mL青霉素、100 u/mL链霉素和10%胎牛血清）培养，使用前以一次性过滤头除菌后密封，备用。

2 方法

2.1 GA和TA的含量测定

2.1.1 色谱条件 将文献[9]方法略作修改，以反相（RT）-HPLC法测定GA和TA的含量。色谱柱：Thermal BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.6%磷酸二氢钾（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：205 nm；进样量：20 μL。

2.1.2 方法学考察 用空白培养基分别制备浓度为1.2、0.6、0.3、0.15、0.1、0.05 mmol/L的TA和GA的混合溶液，其中TA和GA浓度相同。另称取5 g三氯乙酸，加入50 mL水，制备成10%三氯乙酸溶液。分别取TA和GA的混合溶液0.1 mL，置于1.5 mL离心管中，加0.1 mL的培养基，再加入0.2 mL10%三氯乙酸溶液，12 000 r/min（离心半径5 cm）离心2 min。取上清进样测定GA和TA的峰面积，绘制标准曲线。按上述方法制备分别含GA和TA 0.05、0.15、0.6 mmol/L的质控样品，进样分析，每个浓度重复5次，以质控样品中GA和TA峰面积与其直接溶于流动相后测得的峰面积的比值计算GA和TA的回收率。每日测定质控样品5次考察日内精密度，连续测定5 d考察日间精密度。

2.2 苯酚红的含量测定

2.2.1 色谱条件 将文献[10]方法略作修改，以RTHPLC法测定苯酚红的含量。色谱柱：Thermal BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：276 nm；进样量：20 μL。

2.2.2 方法学考察 取500 mg苯酚红溶于1 L水中制备成500 mg/L苯酚红溶液。将500 mg/L苯酚红溶液倍比稀释成125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.91、1.95 mg/L的溶液，进样测定苯酚红的峰面积，绘制标准曲线。按上述方法制备含苯酚红1.95、7.80、31.25 mg/L的质控溶液，进样分析，每个浓度重复5次，以质控溶液中苯酚红的峰面积与其直接溶于流动相后测得的峰面积的比值计算苯酚红的回收率。每日测定质控溶液5次考察日内精密度，连续测定5 d考察日间精密度。

2.3 Caco-2细胞的培养

将Caco-2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃下培养，每隔1 d更换1次培养基。待细胞长至满壁后分装于新的培养瓶传代，直至培养足量的细胞用于试验所需为止。将多余细胞保存在冻存管中，于液氮罐中冻存，备用。

2.4 Caco-2细胞的铺板

取出无菌Trans-well小室中24孔培养板的中间部位并做好标记。取出长势良好的Caco-2细胞，消毒后弃原培养基，加适量消化液，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞轮廓清晰时弃去消化液，加适量新鲜培养液，吹打瓶壁，将细胞吹打至培养液中，混匀。每个小室加400 μL含细胞的培养液，其余孔加400 μL磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照，培养2 h。

2.5 Caco-2细胞紧密度的测定

取出“2.4”项下铺板培养后的Caco-2细胞，消毒后加入4.5 mg/mL的苯酚红溶液200 μL，置于已标记的2个Transwell小室顶端（AP）侧，小室基底端（BL）侧加入100 μL空白培养液。2 h后，分别从小室的AP、BL侧各取100 μL培养液，测定其中苯酚红浓度。根据AP侧和BL侧苯酚红浓度的比值，评价细胞紧密度。

2.6 分组和透过量的测定

试验分为GSP组、GA组、TA组、GSP+GA组和GSP+TA组。将GSP制备成2 mg/mL的溶液，GA、TA制成0.24 mmol/L的溶液，按分组将GSP溶液和GA、TA溶液加入Transwell小室AP侧，使GSP最终质量浓度为1 mg/mL，GA、TA浓度均为0.12 mmol/L。分别于0、2、4、8 h后吸取BL侧100 μL培养液于已标记离心管中，同时补充等量空白培养液，测定培养液中GA、TA的含量。试验重复6次。

3 结果

3.1 GA、TA测定的方法学考察结果

以GA、TA浓度（c）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为GA：A＝631 408c+1 747.8（R2＝0.999 9），TA：A＝381 762c－1 278.5（R2＝0.999 9），线性范围均为0.05～1.20 mmol/L。0.05、0.15、0.6 mmol/L浓度下GA的回收率分别为（98.2±4.2）%、（98.7± 2.5）%、（99.4±2.3）%（n＝3），日内RSD分别为3.26%、2.53%、2.31%（n＝5），日间RSD分别为2.37%、2.06%、1.62%（n＝5）；TA的回收率分别为（98.6±3.6）%、（98.5±1.2）%、（99.9±1.4）%（n＝3），日内RSD分别为3.65%、1.22%、1.40%（n＝5），日间RSD分别为1.97%、1.29%、1.12%（n＝5）。

3.2 苯酚红测定的方法学考察结果

以苯酚红质量浓度（c）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为A＝20 280c+451.66（R2＝0.999 6），线性范围为1.95～125 mg/L。苯酚红在1.95、7.80、31.25 mg/L质量浓度下回收率分别为（98.7± 2.2）%、（99.8±2.5）%、（100.1±1.7）%（n＝3），日内RSD分别为2.23%、2.51%、1.69%（n＝5），日间RSD分别为1.17%、1.67%、2.29%（n＝5）。

3.3 Caco-2细胞紧密度

Caco-2细胞紧密度测定结果见表1。

表1 Caco-2细胞紧密度测定结果Tab 1 Determination results of Caco-2 cell compactness

由表1可知，仅有约3%的苯酚红能通过Caco-2细胞的间隙，说明Caco-2细胞紧密度较高。

3.4 GA和TA的透过量

各组GA和TA的透过量测定结果见表2。

表2 各组GA和TA的透过量测定结果（s，n＝6）Tab 2 Determination results of transport volume of GAand TAin each group（s，n＝6）

表2 各组GA和TA的透过量测定结果（s，n＝6）Tab 2 Determination results of transport volume of GAand TAin each group（s，n＝6）

注：与GA组比较，＊P＜0.01；与TA组比较，#P＜0.01Note：vs.GAgroup，＊P＜0.01；vs.TAgroup，#P＜0.01

时间，GSP+TA组0 0.001 1±0.000 26#0.001 9±0.000 31#0.35±0.052#h0 2 4 8 GA，μmol GSP组TA，μmol GSP组0 0 0 0 GA组0 2.20±0.11 18.01±2.81 31.00±1.52 GSP+GA组0 0.15±0.01＊0.32±0.03＊1.90±0.36＊0 0 0 0 TA组0 3.61±0.49 16.00±2.40 47.01±5.81

由表2可知，随着时间的延长，GA和TA的透过量均有所增加，但是GSP+GA组细胞的GA透过量明显低于GA组（P＜0.01），GSP+TA组细胞的TA透过量明显低于TA组（P＜0.01）。

4 讨论

本研究结果表明，GSP能显著抑制GA和TA透过Caco-2细胞。其原因可能是GSP与胆汁酸盐发生了吸附结合作用，造成胆汁酸盐的理化性质发生改变。胆汁酸盐的细胞跨膜方式为自由扩散和主动转运，其中以主动转运为主，而GSP与胆汁酸盐的氢键吸附改变了胆汁酸盐的空间位阻效应，因此阻碍了其跨膜转运，从而降低了胆汁酸盐通过细胞膜的转运能力[11]。通过比较发现，GSP对TA透过Caco-2细胞的抑制作用强于GA，这可能是GSP羟基对TA的氢键作用强于GA所致。

本研究中GSP可能通过与GA和TA吸附结合，从而显著抑制了胆汁酸盐的小肠跨膜转运，阻断其肠道重吸收，促进了胆汁酸盐的排泄或降解。由此发现，一方面GSP可抑制肠道脂质吸收，另一方面GSP又促进了血液中胆固醇向胆汁酸盐转化，起到双重降血脂作用。

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Effects of Grape Seed Proanthocyanidin on the Transport of Bile Salts in Colon Glandular Cell Caco-2

LAI Lihua1，GE Jian2（1.Dept.of TCM，Guangxingtang Traditional Chinese Medicine，Hangzhou Hospital of TCM，Hangzhou 310007，China；2.Dept.of Pharmacy，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

OBJECTIVE：To study the effects of grape seed proanthocyanidin（GSP）on the transmembrane transport of sodium glycocholate（GA）and sodium taurocholate（TA）in colon glandular cell Caco-2.METHODS：Caco-2 model was used，and RP-HPLC was conducted to determine the contents of GA and TA in cell culture medium.The test was divided into GSP group，GA group，TA group，GSP+GA group and GSP+TA group，the transport volumes of transporting GA and TA from Transwell apical（AP）side to basolateral（BL）side by Caco-2 cell at 0，2，4，8 h were detected，respectively.RESULTS：The linear ranges of GA and TA were 0.05-1.2 mmol/L（R2＝0.999 9）.With the time passing，transport volumes of GA and TA in BL site in GA group and TA group were sharply increased；while the transport volumes were obviously decreased after adding GSP，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：GSP has inhibitory effect on the transmembrane transport of GA and TA in Caco-2 cell.

Grape seed proanthocyanidin；Colon glandular cell caco-2；Sodium glycocholate；Sodium taurocholate；Transmembrane transportation

R361+.3；R932

A

1001-0408（2017）10-1323-03

2016-06-16

2016-08-28）

（编辑：邹丽娟）

国家自然科学基金资助项目（No.31100499）

＊中药师。研究方向：中草药活性。电话：0571-87881603。E-mail：xskathy@163.com

#通信作者：副教授，硕士生导师。研究方向：天然药物。电话：0571-86835702。E-mail：gejian16888@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.07