豨莶草醇提物对多柔比星致小鼠慢性心肌损伤的保护作用Δ

于 静，苏素文，杨继章，何林峰，王可欣，张晓飞（1.河北医科大学第一医院临床药学部，石家庄050031；.河北医科大学基础医学院药理教研室，石家庄 050017）

豨莶草醇提物对多柔比星致小鼠慢性心肌损伤的保护作用Δ

于 静1＊，苏素文2，杨继章1#，何林峰2，王可欣2，张晓飞2（1.河北医科大学第一医院临床药学部，石家庄050031；2.河北医科大学基础医学院药理教研室，石家庄 050017）

目的：探讨豨莶草（HS）醇提物对多柔比星（DOX）致小鼠慢性心肌损伤的影响。方法：将48只小鼠随机分为3组，即空白对照（Con）组小鼠每天ig 1次蒸馏水（2 mL/100 g），并每周ip 1次生理盐水，持续8周；DOX组小鼠每天ig 1次蒸馏水（2 mL/100 g），并每周ip 1次DOX（3 mg/kg），持续8周；DOX+HS醇提物组小鼠每天ig 1次HS（340 mg/kg），并每周ip 1次DOX（3 mg/kg），持续8周。给药结束后，测定小鼠体质量、心脏系数、心功能变化以及血清生化指标[丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）及总胆固醇（TC）]水平。结果：与Con组比较，DOX组小鼠体质量减轻（P＜0.01）；心脏系数升高（P＜0.05）；心率减慢、R波增高（P＜0.05或P＜0.01）；血清中生化指标均有所升高，其中AST差异有统计学意义（P＜0.01）。与DOX组比较，DOX+HS醇提物组小鼠心脏系数降低（P＜0.01）；心率增加（P＜0.01）；血清中生化指标均有所降低，其中CK、LDH、TC差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：HS醇提物对DOX致小鼠慢性心肌损伤有一定的保护作用。

豨莶草醇提物；多柔比星；慢性心肌损伤；小鼠

多柔比星（DOX）是一种高效、广谱的抗肿瘤药，临床上用于急性白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺癌等的治疗。与大多数抗肿瘤药一样，DOX的不良反应较多，最严重的不良反应是剂量依赖性心脏毒性，根据发生时间长短分为急性和慢性心脏毒性。慢性心脏毒性反应的发生与DOX的累积剂量密切相关。当DOX的总量超过400 mg/m2时，约有1%患者出现心肌病变，引起急性心力衰竭；当DOX的累积总量大于550 mg/m2时，心力衰竭的发生率超过4%，病死率可达20%，此为给药上限剂量；当DOX的累积总量大于600 mg/m2时，心力衰竭的发生率达36%[1]。豨莶草（HS）醇提物对DOX所致急性心肌损伤和肝、肾损伤均有保护作用已得到证实[2-3]，但HS醇提物对DOX所致慢性心肌损伤的作用尚未见报道。故本研究拟以多次注射DOX致小鼠慢性心肌损伤来探讨HS醇提物对DOX慢性心肌损伤小鼠的影响。

1 材料

1.1 仪器

CHEMIX-180全自动生化分析仪（日本Sysmes公司）；PICO 17小型台式离心机（德国Thermo公司）；AL104电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Allegra 64R高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；RM-6240BD多通道信号采集处理系统（成都仪器厂）。

1.2 药品、试剂与试剂盒

注射用盐酸DOX（浙江海正药业股份有限公司，批号：110703，规格：5 mL∶10 mg）；肌酸磷酸激酶（CK，批号：ZG3002）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批号：ZG1001）、乳酸脱氢酶（LDH，批号：120815）、总胆固醇（TC，批号：ZG3003）、天冬氨酸转氨酶（AST，批号：ZG3001、ZG3002）、丙氨酸转氨酶（ALT，批号：ZG3011、ZG3012）测定试剂盒均购自日本Sysmex公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 药材

HS由河北祁新中药颗粒饮片有限公司提供（产地：湖北，批号：20120701-1），由河北医科大学第一医院临床药学部杨继章主任药师鉴定其符合2010年版《中国药典》（一部）标准。

1.4 动物

清洁级C57小鼠48只，♀♂各半，由河北省实验动物中心提供，动物合格证号：1510484。

2 方法

2.1 HS醇提物的制备

将2 kg HS水煎2次后浓缩至4 L，加入95%乙醇，边加边剧烈搅拌至乙醇体积分数为70%。过滤后回收乙醇，烘干，收集粉碎并称质量，共得HS醇提物70 g，每1 g HS醇提物相当于28.57 g生药。实验前用蒸馏水溶解制备成所需质量浓度样品溶液。

2.2 分组、给药与造模

实验动物适应性喂养1周后随机分为3组，即空白对照（Con）组、DOX组和DOX+HS醇提物组，每组16只（♀♂各半）。ig给药，给药体积均为2 mL/100 g，Con组和DOX组小鼠ig等体积蒸馏水，DOX+HS醇提物组小鼠ig HS醇提物340 mg/kg[2-3]，每天1次，连续8周。在给药同时，DOX组与DOX+HS醇提物组小鼠均ip DOX（3 mg/kg），每周1次，连续8周，以诱导慢性心肌损伤模型[4]；Con组小鼠则ip等体积生理盐水。

2.3 症状和体征的观察

观察小鼠一般精神状况、饮食、皮毛等情况，并于末次给予DOX 48 h后称定小鼠体质量。

2.4 心电图的测定

各小鼠均ip 1%戊巴比妥钠（5 mg/kg）麻醉，仰位固定，将刺激电极插入小鼠的肢体皮下，采用肢体Ⅱ导联，用RM6240 BD多道生理信号采集处理系统进行心电图图像采集，分析小鼠心率、R波、PR间期和QT间期的变化。

2.5 血清生化指标及心脏系数的测定

小鼠经眼眶取血约5 mL，静置约30 min后，以离心半径为8 cm、3 000 r/min离心10 min，取上层血清。分别测定血清中ALT、AST、TC、CK、CK-MB和LDH水平，所有操作步骤均按测试盒的说明书进行。小鼠经眼眶取血后剖开胸腔，取出心脏，称定各组小鼠心脏质量，计算心脏系数[心脏质量（g）/体质量（g）]。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 HS醇提物对DOX致慢性心肌损伤小鼠一般状况、体质量的影响

Con组小鼠摄食及一般活动在给药期间未见异常；DOX组给药后小鼠摄食量减少，出现竖毛、肢冷、活动时平衡度差的症状，体质量明显减轻（P＜0.01）；而DOX+ HS醇提物组小鼠的一般状况优于DOX组，但体质量变化差异无统计学意义（P＞0.05）。Con组、DOX组、DOX+HS醇提物组小鼠的体质量变化分别为（2.90± 2.10）、（－2.59±1.99）、（－2.39±1.37）g。

3.2 HS醇提物对DOX致慢性心肌损伤小鼠心功能的影响

与Con组比较，DOX组小鼠ECG表现为心率减慢、R波增加、PR间期和QT间期延长，其中心率和R波变化差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与DOX组比较，DOX+HS醇提物组小鼠心率增加、R波减少、PR间期和QT间期缩短，其中心率变化差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表1。

表1 各组小鼠心电图的检测结果（s，n＝16）Tab 1 Detection results of electrocardiogram of micein each group（s，n＝16）

表1 各组小鼠心电图的检测结果（s，n＝16）Tab 1 Detection results of electrocardiogram of micein each group（s，n＝16）

注：与Con组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与DOX组比较，##P＜0.01Note：vs.Con group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.DOX group，##P＜0.01

QT间期，ms 67.81±22.95 106.13±49.99 80.68±48.48组别Con组DOX组DOX+HS醇提物组心率，次/min 409.28±23.60 377.45±36.45＊464.89±66.52##R波，mV 0.34±0.07 0.47±0.08＊＊0.43±0.11 PR间期，ms 17.93±4.77 23.48±5.68 20.92±5.43

3.3 HS醇提物对DOX致慢性心肌损伤小鼠血清生化指标的影响

与Con组比较，DOX组小鼠血清中ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、TC水平均升高，其中AST差异有统计学意义（P＜0.01）；与DOX组比较，DOX+HS醇提物组小鼠血清中上述指标水平均降低，其中CK、LDH、TC差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表2。

表2 各组小鼠血清生化指标的测定结果（s，n＝16）Tab 2 Determination results of serum biochemical indexes of mice in each group（s，n＝16）

表2 各组小鼠血清生化指标的测定结果（s，n＝16）Tab 2 Determination results of serum biochemical indexes of mice in each group（s，n＝16）

注：与Con组比较，＊＊P＜0.01；与DOX组比较，##P＜0.01Note：vs.Con group，＊＊P＜0.01；vs.DOX group，##P＜0.01

组别Con组DOX组DOX+HS醇提物组ALT，U/L 52.74±11.07 59.74±14.91 55.89±13.79 AST，U/L 158.00±27.51 201.14±21.85＊＊199.16±49.57 CK，U/L 843.33±92.39 976.11±178.02 765.33±129.80##CK-MB，U/L 316.67±92.39 340.44±63.03 328.60±48.36 LDH，U/L 846.00±112.61 941.56±147.31 801.40±95.74##TC，mmol/L 1.73±0.46 2.10±0.34 1.71±0.17##

3.4 HS醇提物对DOX致慢性心肌损伤小鼠心脏系数的影响

与Con组[（0.004 40±0.000 99）g/g]比较，DOX组小鼠的心脏系数[（0.005 60±0.000 66）g/g]明显升高（P＜0.05）；与DOX组比较，DOX+HS醇提物组小鼠的心脏系数[（0.004 80±0.000 47）g/g]明显降低（P＜0.05）。

4 讨论

由于DOX可引起剂量依赖性的心脏毒性，而限制了其临床应用[5]，其毒性主要表现为器质性的病变[6]。目前，主要是应用DOX控释剂和联合使用心脏保护剂（如右丙亚胺）来降低DOX的心脏毒性[7-8]。但化学药品往往通过一种机制来降低DOX的心脏毒性，而中药则可能通过多靶点进行拮抗[9]。HS所含化学成分较多，主要有萜类、苷类、生物碱等。研究证明，HS提取物具有舒张血管、降压、抗癌、镇痛、抗菌消炎、抗氧化、抑制免疫功能等活性。日本科学家证实，HS的甲醇提取物有较强的抗氧化性，其活性高于2，3-丁基-4-羟基茴香醚[10]。

本研究采用连续8周重复对小鼠注射DOX致累积中毒剂量的方法，观察HS醇提物是否可拮抗其产生的慢性心肌损伤。笔者前期研究已证明，HS醇提物对DOX所致的急性心肌损伤和肝、肾损伤均有保护作用，以高剂量组作用最为明显[2-3]，故在本研究设计时没有设定不同给药剂量组，只选定高剂量为本次实验剂量。

在本研究中，从小鼠的一般状况来看，与Con组比较，DOX组小鼠均出现竖毛、肢冷、活动力差等现象；与DOX组比较，DOX+HS组上述症状均有所改善。因DOX的半衰期为48～96 h，故本研究的各项指标在DOX注射48 h后进行检测。从小鼠体质量变化来看，Con组小鼠体质量在8周后明显增加，而DOX组小鼠体质量却明显减少，DOX+HS醇提物组小鼠体质量稍增加，但差异无统计学意义。而DOX组小鼠的心脏系数却明显高于Con组，这说明DOX对心脏的损伤可引起实验小鼠的体质量下降，但心脏质量却增加，而心脏质量增加可能是心肌细胞的肿胀和间质水肿所致。与DOX组比较，DOX+HS醇提物组小鼠的心脏系数却降低，这提示HS醇提物对DOX所造成的心脏损伤有一定的对抗作用。DOX组小鼠心电图的心率减慢、R波增高、PR间期和QT间期延长，提示DOX长期累积注射可造成小鼠慢性心肌损伤，而HS醇提物可缓解DOX所致的心电图异常。

CK广泛存在于各种组织中，与三磷酸腺苷的再生有关，此酶的功能是在生理水平上维持细胞内的三磷酸腺苷浓度。CK由M和B两个亚单位组成，组合成CKBB、CK-MM、CK-MB 3种同工酶，其中CK-MB则主要存在于心肌，血清中CK和CK-MB是DOX诱发心肌损害致细胞完整性缺失的定量指示剂[11]。LDH是糖酵解过程中的重要酶，在心肌细胞中的含量远高于其他组织，血清中LDH含量的高低与心肌损伤的程度呈正相关[12]。AST的分布以心肌最高，当心肌细胞受到损伤时，大量释放入血，使其血清含量增加。本研究结果显示，DOX组血清中CK、CK-MB、LDH、TC、ALT、AST水平均升高，而DOX+HS醇提物组小鼠血清中以上各种酶的水平均有所降低，这提示HS醇提物对DOX慢性中毒所致的心肌损伤有一定的保护作用。

综上所述，HS醇提物可改善DOX致小鼠慢性心肌损伤，但究竟是何种成分在起作用还有待进一步研究。

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Protective Effects of Ethanol Extracts from Siegesbeckiae herba on Doxorubicin-induced Chronic Myocardial Injury in Mice

YU Jing1，SU Suwen2，YANG Jizhang1，HE Linfeng2，WANG Kexin2，ZHANG Xiaofei2（1.Dept.of Clinical Pharmacy，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；2.Teaching and Research Section，Basic Medical College of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

OBJECTIVE：To explore the effects of extracts from Siegesbeckiae herba（HS）on doxorubicin（DOX）-induced chronic myocardial injury in mice.METHODS：48 mice were randomly divided into 3 groups.Mice in blank control（Con）group received distilled water once every day，ig，and normal saline（2 mL/100 g）once every day，ip，for 8 weeks；mice in DOX mice received distilled water（2 mL/100 g）once every day，ig，and DOX（3 mg/kg）once every week，ip，for 8 weeks；mice in DOX+ HS group received HS（340 mg/kg）once every day，ig，and DOX（3 mg/kg）once every week，ip，for 8 weeks.After administration，body mass，heart coefficient，cardiac function changes，serum biochemical index levels[alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），creatine phosphokinase（CK），creatine kinase isoenzyme（CK-MB），lactate dehydrogenase（LDH）and total cholesterol（TC）]of mice were determined.RESULTS：Compared with Con group，body mass of mice in DOX group was decreased（P＜0.01）；heart coefficient was increased（P＜0.05）；heart rate slowed down，R-wave was increased（P＜0.05 or P＜0.01）；serum biochemical indexed were increased，there was significant difference in AST（P＜0.01）.Compared with DOX group，heart coefficient of mice in DOX+HS group was decreased（P＜0.01）；heart rate was increased（P＜0.01）；serum biochemical indexes were decreased，there was significant differences in CK，LDH，TC（P＜0.01）.CONCLUSIONS：HS has certain protective effects on DOX-induced chronic myocardial injury in mice.

Ethanol extracts from Siegesbeckiae herba；Doxorubicin；Chronic myocardial injury；Mice

R969.4

A

1001-0408（2017）10-1320-04

2016-09-21

2016-11-12）

（编辑：林 静）

国家自然科学基金资助项目（No.81273600）；河北省自然科学基金资助项目（No.C2011206145）；河北省中医药管理局中医药类科研计划课题（No.2012008）

＊主管药师，硕士。研究方向：临床药理学。电话：0311-85917354。E-mail：38565914@qq.com

#通信作者：主任药师，硕士生导师，教授。研究方向：临床药学。电话：0311-85917352。E-mail：yjzh1957@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.06