调节性T细胞在肝细胞癌患者中的表达频率及意义

许海波

摘要：目的 探讨肝细胞癌患者外周血CD4+CD25high Treg细胞表达频率及其临床意义。方法 选取28例诊断及分期明确的肝细胞癌患者及健康对照20例，流式细胞术检测外周血CD4+CD25high Treg细胞表达频率，并进项统计学分析。结果 肝细胞癌患者Treg细胞比例显著高于健康对照组[（4.91±2.37）% vs （1.62±0.73）%，P<0.05]，差异有统计学意义。且其随肝细胞癌进展不断增加，III期患者显著高于I和II期患者，且均高于健康对照组，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 肝细胞癌患者CD4+CD25high Treg细胞表达频率显著升高且与临床分期相关，提示Treg可能参与肝细胞癌的发生发展。

关键词：肝细胞癌；调节性T细胞；表达

Abstract：Objective To investigate the clinical significance of the expression of CD4+CD25high and the frequency of Treg cells in peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients. Methods 28 cases of diagnosis and staging of hepatocellular carcinoma patients and healthy control group in 20 cases，the frequency of peripheral blood CD4+CD25high expression of Treg cells were detected by flow cytometry，and the input statistics analysis. Results The proportion of liver cells cancer cells in patients with Treg was significantly higher than that in healthy control group[（4.91±2.37）% vs （1.62± 0.73）%，P<0.05]，the difference was statistically significant.With the increasing development of hepatocellular carcinoma，III patients was significantly higher than that in patients with I and II，and were higher than the healthy control group，the differences between groups were statistical significance （P<0.05）. Conclusion The expression frequency of CD4+CD25high Treg cells in hepatocellular carcinoma was significantly increased and correlated with clinical stage，suggesting that Treg may be involved in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma

Key words：Hepatocellular carcinoma；Regulatory T cells；Clinical phase

肝細胞癌是全球主要健康问题之一，平均每年有超过60万患者死于此病[1]。越来越多的证据显示肿瘤与免疫功能紊乱间的密切关系，在肝细胞癌中常见的肿瘤浸润淋巴细胞表明肿瘤触发了免疫反应。既往研究已经证实肿瘤微环境中不同T淋巴细胞亚群扮演不同的作用[2]。CD4+调节性T细胞（Treg）可通过抑制效应T细胞进而负性调控抗肿瘤免疫[3]。类似肿瘤相关免疫反应也在肝细胞癌微环境中存在，提示为肝细胞癌开发免疫疗法具有理论基础。肝细胞癌常规疗法并不能彻底治愈，因为有50%以上患者会在3年内复发。基于以上原因，开发可通过诱导或增强现有肿瘤特异性免疫反应而为患者提供更加有效且靶向肿瘤细胞的免疫疗法显得尤为迫切。而明确不同种类免疫细胞在肝细胞癌患者中的具体作用可能为新的免疫疗法制定提供有效线索。Treg细胞可通过诱导细胞-细胞间联系、TGF-β及IL-10等免疫抑制细胞因子分泌等多途径抑制CD4+和CD8+ T细胞反应，其在乙肝患者中的作用已经获得证实[4]，但关于其在与乙肝密切相关的肝细胞癌患者中的表达情况研究较少。据此，本研究主要探究肝细胞癌患者中Treg细胞表达频率及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年10月～2016年2月于本院肝病科就诊且确诊为肝细胞癌的患者28例，平均（59.26±16.69）岁，其中男16例，女12例；其中I期10例，II期11例，III期7例。所有患者诊断及分期依据中国抗癌协会制定的原发性肝细胞癌诊断及分期标准[5]。同时选取同期健康体检者20例作为对照组，平均（58.33±13.21）岁，男12例，女8例。肝细胞癌患者组和对照组间一般资料均无统计学差异（P>0.05）。

1.2标本采集及测定 抽取体检者体检当日及肝细胞癌患者入院确诊后且未进行治疗时清晨空腹静脉血于EDTA抗凝管中，用于测定Treg细胞比例，所有测试均在采血后2 h内完成。

1.3主要试剂及仪器 CD45-PC7、CD4-FITC、CD25-PC5单抗购自ebioscience公司；FC500流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.4流式细胞检测CD4+CD25high Treg细胞比例 取肝细胞癌患者和健康对照者EDTA抗凝静脉血50 μL于流式检测管底，加入CD4和CD25抗体各20 μL室温避光孵育20 min，加800 μL红细胞裂解液混匀，室温避光15 min，离心去上清；用PBS 洗2次去上清，加500 μL PBS重悬上机，根据CD45和SSC圈定淋巴细胞群，再对CD4+ T淋巴细胞进行设门，圈定CD4+CD25high Treg细胞群，同时设置同型对照，数据收集及分析采用 CXP Cytometer处理。

1.4统计学处理 以SPSS 19.0统计学软件分析数据，所有实验数据均以平均值±标准差（x±s）形式表示，组间Treg細胞平均水平比较采用t检验，以P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肝细胞癌患者外周血Treg细胞比例 分析肝细胞癌和健康对照者外周CD4+CD25high Treg细胞比例，结果发现肝细胞癌患者Treg细胞比例显著高于健康对照组[（4.91±2.37）% vs （1.62±0.73）%，P<0.05]，差异有统计学意义。

2.2肝细胞癌患者外周血Treg细胞比例与临床分期间的关系

进一步分析发现Treg细胞随肝细胞癌进展比例不断增加，III期患者显著高于I和II期患者，且均高于健康对照组，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

免疫平衡紊乱与肿瘤的发生发展间存在密切关联，肿瘤发生是肿瘤细胞免疫逃逸的结果，而免疫效应细胞在此过程扮演重要角色，近年来大量研究证实Treg与肿瘤免疫监视及促进肿瘤发生进展密切相关。CD4+CD25high Treg细胞是维持免疫耐受的重要因素之一，其主要功能即限制T细胞的活化，调控免疫反应，进而保护机体避免自身免疫性疾病发生。目前已经证实Treg细胞介导的免疫逃逸是肿瘤免疫中至关重要环节，其也是抗肿瘤治疗失败的主要原因之一。Treg细胞可促进肿瘤细胞逃避免疫监视进而导致肿瘤侵袭转移[6]。

本研究通过对肝细胞癌患者及健康对照体内Treg细胞比例测定发现癌症患者外周CD4+CD25high Treg细胞比例显著高于健康对照组，差异有统计学意义。进一步分析发现该细胞比例与临床分期相关，随着肝细胞癌临床进展不断增加。

以上研究结果提示肝细胞癌患者CD4+CD25high Treg细胞比率明显高于健康组，说明肝细胞癌患者Treg升高，机体细胞免疫功能受到抑制，可能与CD4+CD25high Treg细胞的免疫抑制作用导致肝细胞癌患者抗肿瘤免疫应答受到抑制有关，使机体无法对现有肿瘤细胞进行有效清除。

参考文献：

[1]Llovet J M，Bruix J.Llovet JM，Bruix J.Novel advancements in the management of hepatocellular carcinoma in 2008.J Hepatol 48 （Suppl 1）：S20-S37[J].2008，48 Suppl 1（Suppl 1）.

[2]Curiel T J，Coukos G，Zou L，et al.Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival[J].Nature medicine，2004，10（9）：942-949.

[3]Roychoudhuri R，Eil R L，Restifo N P.The interplay of effector and regulatory T cells in cancer[J].Current Opinion in Immunology，2015， 33：101.

[4]Liang X S，Li C Z，Ying Z，et al.Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection[J].BMC Gastroenterology，2012，12（1）：43.

[5] Sheng J M，Zhao W H，Wu F S，et al.The Chinese classification system compared with TNM staging in prognosis of patients with primary hepatic carcinoma after resection[J].国际肝胆胰杂志（英文），2005，4（4）：561.

[6]Wolf D，Sopper S，Pircher A，et al.Treg（s） in Cancer： Friends or Foe？[J].Journal of Cellular Physiology，2015，230（11）：2598-2605.

编辑/罗茗柯