重组腺病毒载体埃博拉疫苗的工艺特点和技术创新

▷撰稿 朱涛

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重组腺病毒载体埃博拉疫苗的工艺特点和技术创新

▷撰稿 朱涛

朱涛，天津科技大学教授，国家千人计划入选者。1998年获清华大学化学工程硕士学位，2002年获美国匹兹堡大学生物化学工程博士学位。2002-2004年在美国卡内基梅隆大学从事博士后研究；2004-2005年在芝加哥 IntegratedGenom⁃ics Inc任职科学家，从事生物信息学和代谢工程的研究；随后加入世界疫苗巨头——赛诺菲巴斯德(Sanofi Pasteur)从事疫苗开发。2009年回国创办天津康希诺生物技术有限公司，专业从事疫苗及其他生物制品的开发，任公司研发副总、首席科学家。

埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD），是迄今发现的感染性最强的传染性疾病之一。埃博拉病毒属分5个亚种，即埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire）、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan）、埃博拉-莱斯顿型（EBO-Reston）、埃博拉-科特迪瓦型（EBO-tai forest）和本迪布焦型（EBO-bun⁃dibugyoe）[1]。不同亚种具有不同的特性，EBOZaire和EBO-Sudan对人类和非人类灵长类动物的致病性和致死率很高；2014年西非爆发的埃博拉疫情就是EBO-Zaire引起的。EBO-Reston对人类不致病，对非人类灵长类动物具有致死性作用；EBO-tai forest对人类有明显的致病性，但一般不致死，对黑猩猩的致死率很高。

目前没有有效的药物可以治疗埃博拉感染性疾病，WHO推荐的治疗原则是口服或静脉补液以维持电解质平衡，维持血压，控制体温和治疗并发症等综合措施，但是这些治疗的主要目标是阻止或者缓解疾病所造成的损伤，减轻病痛，临床效果一般。通常采取快速大规模的隔离、针对死者的安全深埋和辅助治疗等措施综合来控制埃博拉爆发流行。开发有效针对埃博拉病毒的疫苗对于防治病毒的再次爆发流行有重要的作用。

我国研发的埃博拉疫苗采用重组腺病毒载体技术，是本轮流行期国际上第3个进入临床研究的埃博拉疫苗，也是我国第一个在国外进行临床研究的疫苗。本文尝试综述重组腺病毒载体埃博拉疫苗的工艺、产品特点，为同类疫苗的研发提供思路。

1 重组腺病毒载体埃博拉疫苗的放大及冻干工艺研究

用于重组腺病毒载体埃博拉疫苗生产的HEK293SF-3F6细胞为加拿大国家科学理事会（National Research Council Canada，NRC）开发的可在无血清培养基中悬浮培养生产病毒载体和重组蛋白的细胞株。相比较传统的HEK293细胞，该细胞株的主要优势是以无血清培养基作为生长条件，适应悬浮培养，无需微载体，可以直接放大生产，细胞培养工艺简单。NRC在GMP条件下建立原代细胞库，细胞株的来源清楚，驯化过程均有详细和完整的实验记录，并且进行了全方位的检定。符合GMP要求，可用于人用疫苗生产。康希诺公司于将NRC引进的HEK293SF-3F6细胞株作为原代，在GMP条件下复苏该细胞株，建立主细胞库和工作细胞库，并获得中检院的合格检定报告。

重组腺病毒载体埃博拉疫苗小试发酵工艺采用摇瓶培养的方法，由于生产用的细胞株已经适应悬浮培养，因此200mL小试规模参数的探索相对容易。从摇瓶培养，经7.5 L发酵罐的放大，到50 L发酵放大，再到目前的200 L发酵工艺，逐步实现发酵工艺的放大。细胞在发酵罐中的悬浮高密度培养是病毒疫苗和抗体生产过程中最难克服的关键工艺之一。实现细胞在不同发酵规模下的高密度培养，需要解决如何合理的控制溶氧，细胞生长代谢过程中会产酸，培养基pH的调节采用什么试剂，如何确定合理的pH范围从而保证细胞的生长速度快。由于发酵罐有搅拌桨，那么搅拌过程中的剪切力对细胞生长的影响如何消除等等，只有解决这些技术才可以实现细胞悬浮高密度的培养。目前重组腺病毒载体埃博拉疫苗采用一次性反应器的生产技术，已经实现200 L发酵规模的生产。

同理，病毒感染过程中需要确定最佳的感染时间，最佳的感染量（MOI），病毒感染后在病毒繁殖期间，维持细胞生长所需要的最佳pH、最佳溶氧以及降低搅拌桨对细胞活性的影响。病毒感染后什么时候收获细胞可以使病毒的产量最高。每一个因素都影响最后回收样品的病毒滴度（IFU）。从200mL的摇瓶工艺开始就探索每一个参数，7.5 L和50 L发酵规模放大的时，基于小试工艺参数进行再次优化，最终实现200 L规模下高表达的病毒生产工艺。

重组腺病毒载体埃博拉疫苗的纯化，需要实现三个目的：第一，疫苗的纯度大于90%，一般为95%，无多聚体。第二，残余DNA和蛋白质的含量满足中国药典的要求。第三，原液可在缓冲液中稳定保存，既不聚集也不降解。原则上最佳的纯化工艺是步骤相对少，回收率相对高。小试纯化工艺研究中，我们尝试个多个不同的填料，不同的填料组合，不同的缓冲液和洗脱条件，最终确定采用先通过Sepharose Q HP去除蛋白/核酸和细胞碎片，然后经过 Capto Core 700进行病毒的精纯；中试放大中进一步优化了最佳上样量，确定了洗脱条件和样品的收集范围，经过多批次的研究结果证明，通过两步纯化工艺得到的腺病毒纯度高达95%。埃博拉疫苗原液保存的缓冲液的选择最为关键，是直接影响病毒活性和纯度的关键辅料。以DOE软件设计多种原辅料组合，通过测定37℃加速和2～8℃长期稳定性研究中腺病毒IFU和纯化的变化，最后确定适合保存埃博拉疫苗原液的最佳配方。

重组腺病毒载体埃博拉疫苗为冻干制剂，是世界上的第一个重组埃博拉疫苗冻干制剂，可在2～8℃长期保存，在37℃下暴露2周，活力不降低。冻干制剂的开发需要解决一系列技术难题，如何减少冻干前后腺病毒活力的降低，如何减少冻干过程中病毒聚集，如何合理设计冻干曲线从而保证疫苗的水分符合要求，并使产品具有较好的长期稳定性，如何原辅料的配伍，以及如何保证冻干制剂的外观符合要求，且加入稀释剂后可快速溶解等一系列难题。此外还需要探索冻干样品从小试，到中试放大过程中，冻干曲线是否合适，前期小试确定的冻干工艺参数是否适合中试放大，中试规模最佳的冻干曲线和制剂生产工艺。经过一系列实验，最终实现30 000剂/批的成品生产。

在WHO组织的有关埃博拉疫苗主题讨论中，该制剂工艺赢得同行的赞赏。同期在非洲开展临床实验的以黑猩猩3型腺病毒为载体构建的埃博拉疫苗（葛兰素史克公司）保存在-80℃，而为了有效保证-80℃冰箱的正常工作，GSK特异配备发电设备，且有专人24 h值班，而且实验疫苗的来回运输也是颇费周折。而重组腺病毒载体埃博拉疫苗则可保存在常规冰箱，来回运输通过常规的冷藏箱即可实现，非常便利，受到塞拉利昂药材局长和卫生部长的高度认可。

2 重组腺病毒载体埃博拉疫苗有效克服预存免疫

以5型腺病毒为载体开发疫苗，最大的担忧就是预存免疫有可能会影响疫苗的临床效果；临床试验结果表明增加免疫剂量或者采用加强免疫均可有效避免预存免疫对埃博拉疫苗免疫效果的影响。

Ⅰ期临床研究发现，75%～85%受试者体内具有5型腺病毒的中和抗体，而55%～63%受试者体内具有更高滴度的腺病毒中和抗体；临床研究结果表明，受试者体内的腺病毒中和抗体可以减弱疫苗激发的抗GP糖蛋白特异性的抗体反应，但是低剂量组更为明显；总之，增加免疫剂量可有效避免预存免疫对埃博拉疫苗的影响[2]。

无论是高剂量组，还是低剂量组，初免受试者体内均产生有效的免疫反应，但是从28天抗GP蛋白抗体滴度达到高峰之后，抗体滴度开始下降，至6月时抗体滴度下降到较低的水平。初免6月后以相同的疫苗和剂量进行加强免疫，结果表明，无论加强免疫时受试者体内抗5型腺病毒中和抗体水平的高低，两个剂量组，加强免疫后都产生很强的抗GP蛋白的抗体反应，抗GP蛋白抗体滴度远高于初次免疫时的抗体滴度；提示重组埃博拉疫苗通过加强免疫也可有效克服预存免疫对疫苗的影响[3]。

3 重组腺病毒载体埃博拉疫苗技术应用展望

重组埃博拉病毒载体疫苗采用腺病毒载体技术，腺病毒载体疫苗既可诱导体液免疫，也可以诱导细胞免疫，无需佐剂，可以通过肌肉注射或者粘膜免疫，是非常理想的疫苗载体。腺病毒载体疫苗广泛应用于各种预防性和治疗性疫苗的开发，包括艾滋病、流感、塞卡病毒病、乙肝、HPV感染、前列腺癌、丙肝、狂犬病及结核病的疫苗，是目前最有应用前景的疫苗载体之一[4]。

据saranya Sridhar的统计，截至2015年，有15个不同的埃博拉疫苗处于临床前药效学研究阶段，8个疫苗处于不同的临床阶段。这8个处于临床阶段的埃博拉疫苗，除了1个为VLP蛋白疫苗，一个为DNA疫苗外，其余6个均为病毒载体疫苗，其中3个均为腺病毒载体疫苗[5]。

腺病毒作为平台技术高表达、易于生产、质量可控；公司建立的腺病毒载体平台技术可实现应急疫苗的快速研发和制备，该平台技术已经应用于结核病，马尔堡和寨卡疫苗的开发。基于腺病毒载体技术平台开发的重组结核病疫苗已经在加拿大完成临床I期研究，正在进行粘膜免疫（喷雾给药）。口服制剂或者粘膜给药技术的研发，包括生物矿化，将极大增强腺病毒平台技术的适用性；为更多新型疫苗的开发提供新的技术途径。

参考文献

[1]李昱,任翔,刘翟,等.埃博拉病毒病流行病学、生态学、诊断、治疗及控制[J].科学导报,2014,32 (24):17-26.

[2]Zhu F C,Hou L H,Chen W,et al.Safety and im⁃munogenicity of a novel recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine in healthyadultsin China:preliminary reportofa randomised,doubleblind,placebo-controlled,phase 1 trial[J].Lancet, 2015,385(9984):2272-2279.

[3]Li J X,Hou L H,Chen W,et al.Immunity dura⁃ tion of a recombinant adenovirus type-5 vectorbased Ebola vaccine and a homologous prime-boost immunisation in healthy adults in China:final report ofa randomised,double-blind,placebo-controlled, phase 1 trial[J].Lancet Glob Health,2017,5(3):e324-e334.

[4]杨勇,周东明.腺病毒载体疫苗的临床研究进展[J].生命的化学,2014,34(1):46-51.

[5]Sridhar S.Clinical development of Ebola vaccine[J].Ther Adv Vaccines,2015,3(5-6):125-138.

（特邀编辑：侯利华）

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.003