不同慢性阻塞性肺疾病大鼠模型体内调节性T细胞变化

戴百章 任朝凤 郑勤玲 杨艳霞 李梅华

不同慢性阻塞性肺疾病大鼠模型体内调节性T细胞变化

戴百章 任朝凤 郑勤玲 杨艳霞 李梅华

目的 通过对比不同大鼠模型体内调节性T细胞变化，探讨适于进行模拟研究慢阻肺患者体内调节性T细胞变化大鼠模型。方法 大鼠随机分为3组，空白对照组，气道滴入脂多糖+烟熏建立慢阻肺模型组(脂多糖+烟熏组)、持续烟熏建立慢阻肺模型组(持续烟熏组)，比较不同建模方案大鼠病理改变，研究不同建模方案大鼠体内T细胞变化。结果 空白对照组与慢阻肺模型组平均内衬间隔之间结果有显著性差异；空白对照组与脂多糖+烟熏组平均肺泡数结果有显著性差异；持续烟熏组大鼠外周血Treg流式细胞检测计数低于空白对照组。结论 持续烟熏组大鼠外周血Treg下降明显，炎症反应轻于脂多糖+烟熏组。持续烟熏大鼠可能更适于进行模拟研究慢阻肺患者体内调节性T细胞变化。

慢性阻塞性；大鼠；调节性T细胞

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)目前定义为一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，多呈进行性发展，与气道和肺组织对香烟烟雾或有害颗粒的慢性炎症反应增强有关[1]。目前国内大鼠慢阻肺造模方案主要有气道滴入脂多糖、气道滴入脂多糖+烟熏造模方案和单纯烟熏造模方案[2-3]等。本实验拟比较不同慢阻肺建模方案大鼠体内调节性T细胞(Treg)变化，探讨更适于进行模拟研究慢阻肺患者体内调节性T细胞变化大鼠动物模型。

资料与方法

一、动物与分组

7周龄雄性清洁级SD大鼠30只，质量190-220g，由昆明医科大学附属动物实验中心提供。30只大鼠随机分为3组，每组10只大鼠。分别为空白对照组，气道滴入脂多糖+烟熏建立慢阻肺模型组(脂多糖+烟熏组)、持续烟熏建立慢阻肺模型组(持续烟熏组)。

二、模型的建立

脂多糖+烟熏组建立慢阻肺模型组建立方法为雄性SD大鼠，第1天、14天气管内注入脂多糖200ug/200uL,其余时间每日上午在35cm x 40cm×50cm(容积70 L)的密闭箱内暴露于10支香烟烟雾中，箱中烟雾浓度约为5%0.5h(香烟焦油含量23 mg/支，上海卷烟厂)，持续6月[3]。持续烟熏组为：每次被动吸烟30-45 min，每周6天，持续6个月。每天定时计算进食量，每2周测量身长、尾长、体质量。所有大鼠均给予普通饮食饲养，自由进食、进水。空白组仅每天给予普通饮食饲养，自由进食、进水。

三、流式细胞仪检测

四、CRP采用ELISA试剂盒进行检测，血常规采用显微下计数器计数，肺平均内衬间隔及肺泡计数采用病理切片常规染色后检测。肺平均内衬间隔(Lm)：检测方式为通过显微镜视野中央“十”字交叉线的肺间隔数(NS)。测出十字线的总长度(L)，以L/NS即得Lm，其数值反映肺泡平均直径。测量时应尽量避开支气管及血管。每张切片测8个视野，然后取平均值。平均肺泡数(MAN)：计数每个视野内的肺泡数，除此视野的面积，即得MAN，其数值反应肺泡密度。测量时应尽量避开支气管及血管。每张切片同样测8个视野，求平均值[4]。

结 果

一、大鼠采用不同建模方案显示，持续烟熏组肺平均内衬间隔较大，脂多糖+烟熏组平均肺泡数较小，可能炎症反应较剧，致肺泡破坏明显。其中空白对照组与慢阻肺模型组平均内衬间隔之间结果有显著性差异。空白对照组与脂多糖+烟熏组平均肺泡数结果有显著性差异(见表1)。

二、大鼠建模第6月空白对照组、脂多糖+烟熏组及持续烟熏组血常规及炎性因子C反应蛋白检测示持续烟熏组红细胞增加比较明显，但可能样本量小，结果无统计学意义，C反应蛋白结果显示三组间有组间差异(F=8.93，P<0.001,见表2)

三、空白对照组、脂多糖+烟熏组及持续烟熏组不同时间大鼠外周血Treg流式检测计数显示在第6月，持续烟熏组大鼠外周血Treg流式细胞检测计数与空白对照组结果之间有显著性差异，结果提示持续烟熏组存在外周血Treg细胞数目下降。(见表3)。

表1 第6月空白对照组、脂多糖+烟熏组及

注：*P<0.01

表2 第6月大鼠空白对照组、脂多糖+烟熏组及持续烟熏组

表3 空白对照组、脂多糖+烟熏组及持续烟熏组建模

注：*P<0.01

讨 论

由于Treg是一种免疫调节细胞,不同大鼠模型中其炎症细胞表达可能存在差异，从而影响体内Treg细胞的表达。刘君波在气管滴入脂多糖建立慢阻肺模型中发现，模型组及对照组灌洗液中中性粒细胞数量分别为93.4147.57×109/L,10.21±6.75×109/L.淋巴细胞数量分别为92.71±31.56×109/L,19.41±11.47×109/L。灌洗液中中性粒细胞及淋巴细胞数量均明显高于对照组[4]，表明脂多糖能引起大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞变化，可能导致慢阻肺模型中大鼠炎症反应较重，也可能影响大鼠体内Treg细胞的表达。陈茜等通过烟薰法建立大鼠模型，研究了烟薰法建立的大鼠慢性阻塞性模型的肺功能动态变化，研究表明烟薰时间对大鼠肺功能和炎症反症有显著的影响[12]，表明烟薰时间对大鼠体内炎症有一定的影响。

本研究采用成熟的大鼠慢阻肺建模方案，比较了不同的大鼠模型，脂多糖+烟熏组及持续烟熏组体内病理变化、血常规、炎性因子及调节性T细胞变化，结果显示：持续烟熏组肺平均内衬间隔较大，脂多糖+烟熏组平均肺泡数较小，脂多糖+烟熏组及持续烟熏组C反应蛋白检测示脂多糖+烟熏组C反应蛋白较高，可能与脂多糖引起机体炎症反应较剧，致肺泡破坏明显有关。持续烟熏组大鼠外周血Treg流式细胞检测计数与空白对照组结果之间有显著性差异，Lee SH, Goswami S研究也表明具有和肺气肿的吸烟人群中，其体内的Treg和FOXP3信使RNA数量比肺功能正常的吸烟人群少[13]。

本研究提示持续烟熏组大鼠外周血Treg下降明显，炎症反应轻于脂多糖+烟熏组。持续烟熏组可能更适于进行模拟研究慢阻肺患者体内调节性T细胞变化。

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Variation of regulatory T cell of different rat model with chronic obstructive pulmonary disease

DAIBai-zhang,RENCao-feng,ZHENGQin-ling,YANGYan-xia,LIMei-hua

theFirstPeople'sHospitalofKunming,Kunming,Yunnan650000,China

Objective To compare the variation of regulatory T cell (Treg) of different rat model with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) to choose appropriate COPD rat model studying change of Treg in vivo. Methods Rats were randomly divided into the control group, the lipopolysaccharide into airway group, and the continuous smoking group respectively. The pathology and the variation of regulatory T cell (Treg) of different rat model with COPD were compared. Results There was significant difference in pulmonary mean linear intercept (MLI ) between the control group and the COPD group. Mean alveolus number was significantly different between the control group and the lipopolysaccharide and smoking group. Treg of peripheral blood counting by flow cytometry in the smoking group was lower than in the control group. Conclusion There is lower Treg of peripheral blood in the smoking group and lighter inflammation comparing with the lipopolysaccharide and smoking group. Smoking rat may be more suitable for stimulate studying the variation of regulatory T cell in patients with COPD.

chronic obstructive pulmonary; rat; regulatory T cell

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.026

云南省应用基础研究计划项目(No 2013ZF223)

650000 云南 昆明，昆明市第一人民医院，呼吸内科

李梅华，E-mail:376678508@qq.com

2016-08-30]