响应面法优化云南永仁野生黄牛肝菌多糖微波辅助提取工艺及其抗氧化活性研究

李 丽,李 羚,刘孟江,苏 鹏

(保山学院资源环境学院,云南保山 678000)

响应面法优化云南永仁野生黄牛肝菌多糖微波辅助提取工艺及其抗氧化活性研究

李 丽,李 羚,刘孟江,苏 鹏

(保山学院资源环境学院,云南保山 678000)

以云南永仁野生黄牛肝菌为原料,采用响应面法对微波辅助提取野生菌多糖的工艺进行研究。在单因素实验基础上,选择料液比、水浴温度、水浴时间进行3因素3水平中心组合设计实验,再利用响应面设计法优化黄牛肝菌多糖的提取工艺,并测定了黄牛肝菌多糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟自由基(OH·)的清除作用。结果表明:黄牛肝菌多糖的最佳提取工艺:水浴温度78 ℃,液料比52∶1(mL/g),水浴时间2.60 h,微波时间70 s,微波功率350 W,在此条件下多糖平均得率为14.74%,与预测值(14.77%)相比,相对误差较小,为0.35%。黄牛肝菌多糖对DPPH自由基及OH·均有一定的清除作用,且随其随浓度的增大而增大。

黄牛肝菌,多糖,微波辅助,响应面法,抗氧化活性

牛肝菌是名贵稀有的野生食用菌,为“四大菌王”之一,主要有白、黄、黑三种,其中,云南的野生牛肝菌资源较为丰富。因其味道鲜美、营养丰富,牛肝菌一直深受相关研究者的青睐,目前,有关牛肝菌资源的研究多见于营养成分提取、分析及其活性测试方面,研究表明:牛肝菌具有高优质蛋白质、低脂肪、低热量等特点,富含钾、铁、锌等矿物质元素以及多糖、黄酮、多酚、维生素B2和挥发性物质等[1-4],既是良好的天然食品,又是较好的药用资源。

作为牛肝菌中的一种,黄牛肝菌(BoletusauripesPk.),别名黄赖头、老虎头,新鲜野生黄牛肝菌肉肥厚,为世界性著名的优质食用菌,含有丰富的有益于人体健康的化学成分,具有清热除烦、养血、追风散热、补虚提神等药效。目前,有关黄牛肝菌的研究主要见对其挥发性成分及部分化学成分研究[3,5],而对其多糖的提取及活性分析还较为少见。云南永仁县位于楚雄州西北部,四川省南部,全县森林综合覆盖率达81.95%,孕育了丰富的野生食用菌资源,其中,黄牛肝菌是产量及品质较高的食用菌之一,但是,由于缺乏对地方资源的研究基础及开发应用意识,当地丰富的野生菌资源并没有给百姓的经济带来贡献和改变,因此,对永仁黄牛肝菌资源的研究,具有重要的现实意义。

目前有关黄牛肝菌多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酸碱浸提法、酶法、超声波辅助法、微波法等,其中微波辅助法以操作简单、节能环保提取高效等特点深受研究者青睐,如:王伟平[6]等采用微波前处理-热水浸提美味牛肝菌菌体胞内多糖,与热水直接浸提法相比,微波前处理-热水浸提能显著缩短提取时间,提高提取率。谢美华[7]等采用热水法、超声波法、微波法提取了紫红牛肝菌粗多糖,结果表明:微波法提取效果最佳。响应面法是一种较为合理的实验设计方案,它通过建立多元二次回归数学模型,达到优化工艺参数并预测响应值的目的[8]。

本研究以云南永仁县野生黄牛肝菌为研究对象,微波辅助法提取多糖,在单因素实验基础上,采用响应面实验法对黄牛肝菌多糖进行优化,以期为地方黄牛肝菌资源的重视及进一步开发利用提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

黄牛肝菌 7月份采自云南永仁杂丛林中,洗净,切片、置于电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干,粉碎过80目,得黄牛肝菌样品粉,密封干燥保存备用;苯酚、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、VC、DPPH、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢等试剂 均为分析纯。

DFT-200手提式高速万能粉碎机 温林市林大机械制造厂;MW20-M605微波炉 广东欧派集团有限公司;N-1001D旋转蒸发仪 东京理化;800离心机 中外合资深圳天南海北有限公司;HH-S26S数显恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂;721可见分光光度计 上海菁华科技有限公司;CP214电子天平 奥豪斯仪器上海有限公司；EPED-10TH实验室超纯水器 南京易普易达科技发展有限公司;DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄牛肝菌多糖的提取 黄牛肝菌样品粉→微波浸提→热水浸提→冷却至室温后离心分离→上层清液定容测定样品液多糖含量→上层清液于60 ℃旋转蒸发浓缩至1/4体积→加入95%乙醇,4 ℃沉淀过夜→沉淀依次用85%乙醇溶液、丙酮洗涤3次→60 ℃干燥至恒重→黄牛肝菌多糖,密封保存,备用。

1.2.2 单因素实验 经查阅大量相关文献,选择对黄牛肝菌多糖得率有影响的5个因素:微波时间、微波功率、液料比、水浴温度、水浴时间进行单因素实验。设定液料比40∶1 mL/g、微波功率350 W、水浴温度90 ℃、水浴时间2 h,选择微波时间(30、60、70、80、90、120 s)。设定液料比为40∶1 mL/g、微波时间为70 s、水浴温度90 ℃、水浴时间2 h,选择微波功率为70、210、350、490、700 W。设定微波功率350 W、微波时间70 s、水浴温度90 ℃、水浴时间2 h、选择液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g。设定液料比40∶1 mL/g、微波功率350 W、微波时间为70 s、水浴时间2 h,选择水浴温度60、70、80、90 ℃。设定液料比40∶1 mL/g、微波功率350 W、微波时间为70 s、水浴温度90 ℃,选择水浴时间1、1.5、2、2.5、3 h。每组实验做三次平行,取其平均值。

1.2.3 响应面实验设计 在单因素实验的基础上,结合实际实验条件,采用Design-Expert软件中的Box-Behnken组合设计法[9-10],选取显著性较高的三个因素(p<0.05):液料比(A)、水浴温度(B)和水浴时间(C),进行3因素3水平分析实验,优化黄牛肝菌多糖提取工艺,其因素水平设计见表1。

表1 响应面实验因素与水平

1.2.4 标准曲线的绘制及多糖含量的测定 标准曲线的绘制采用硫酸-苯酚法,参照文献[11],以葡萄糖为标准,在490 nm测定吸光度,以葡萄糖浓度c为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为A=6.125c+0.0064(R2=0.9996)。

精确量取0.8 mL黄牛肝菌多糖样品液,按上述方法测定吸光度,代入回归方程得多糖浓度,按下式计算多糖得率。

多糖得率(%)=(提取液中多糖质量/样品质量)×100

1.2.5 牛肝菌多糖抗氧化能力测定 分别准确称取黄牛肝菌多糖及VC各25 mg,配制成1000 μg/mL溶液,并按二倍稀释法分别稀释至500、250、125、62.5 μg/mL。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 参照王之珺[12]等报道的方法稍作修改,在5支10 mL具塞比色管中分别加入1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2.0 mL,各加入不同浓度的黄牛肝菌多糖水溶液0.5 mL,然后再加入1.5 mL水充分混匀,在避光处静置30 min后,加水稀释至10 mL。以水代替DPPH溶液为对照组,以水代替样品溶液作空白组离心分离,取上层清液在520 nm处测其吸光度。以同浓度VC作阳性对照。

其中,A1为加入多糖样品所测吸光度,A2为用同体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液所测吸光度,A0为用同体积蒸馏水代替多糖样品溶液的空白对照组的吸光度。

1.2.5.2OH·清除能力 参照文献[13-14]方法稍作修改,在5支10mL具塞比色管中分别加入9mmol/L硫酸亚铁水溶液,9mmol/L水杨酸无水乙醇溶液,3%过氧化氢水溶液和不同质量浓度的多糖样品各1.0mL,于37 ℃水浴中反应30min,冷却至室温后,加水稀释到10mL后,在510nm处测定其吸光度。以同浓度的VC为阳性对照。

其中,A1为加入多糖样品液所测吸光度,A2为用同体积蒸馏水代替过氧化氢溶液所测吸光度,A0为用同体积蒸馏水代替多糖样品溶液的空白对照组的吸光度。

1.3 数据处理

单因素及抗氧化实验采用Excel 2010对数据进行分析,采用Design-expert.v8.0.6.1进行响应面分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 微波时间对多糖得率的影响 由图1可知,随着微波时间的增加,多糖得率显著增大,当微波时间为70 s时,得率最高,达13.58%。此后,增加微波时间,多糖得率反而减少。这可能是因为适当的微波能使黄牛肝菌细胞内部温度升高、压力增大,细胞有效破裂,多糖快速溶出;但当加热时间过长时,会导致系统温度过高,部分多糖结构遭到破坏而造成损失。因此,实验中微波时间不宜过长,70 s为宜。

图1 微波时间对多糖得率的影响Fig.1 Effect of microwave times on polysaccharides extraction rate

2.1.2 微波功率对多糖得率的影响 由图2可知:微波功率对多糖得率的影响呈现先增大后减小的趋势,当功率为350 W时,得率最大,达13.30%。原因可能是微波功率较小时,系统接受的微波能较少,分子运动速度慢,不利于多糖溶出;当微波功率过大时,一方面会破坏多糖的结构,另一方面会导致溶剂挥发,都不利于多糖的有效提取。因此,最佳微波功率为350 W。

图2 微波功率对糖得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharides extraction rate

2.1.3 液料比对多糖得率的影响 由图3可知:当液料从30∶1～50∶1(mL/g)时,多糖得率逐渐上升,但当液料比从50∶1到70∶1(mL/g)时,得率逐步下降。原因可能是当液料比过高时,溶剂将消耗大量微波能而不利于黄牛肝菌细胞破裂。因此,选最佳液料比为50∶1(mL/g),此时,黄牛肝菌多糖得率达14.00%。

图3 料液比对多糖得率的影响Fig.3 Effect of the ratio between solvent and material on polysaccharides extraction rate

2.1.4 水浴温度对多糖提取率的影响 由4可知:在60～80 ℃区间内,随温度升高多糖得率也增大。当温度达80 ℃时,得率最大,达14.30%。其后,升高温度多糖得率下降。因此,选最佳水浴温度为80 ℃。

图4 水浴温度多糖提取率的影响 Fig.4 Effect of the temperature of the water bath on polysaccharides extraction rate

图5 水浴时间对多糖提取得率的影响Fig.5 Effect of the times of the water bath on polysaccharides extraction rate

2.1.5 水浴时间对多糖得率的影响 由图5可知:随着水浴时间的增长,多糖得率不断升高,而后又下降,在2.5 h得率达最大值,为13.80%。可能是由于水浴时间过短多糖溶解不充分,不能被有效提取,但是当水浴时间过长时,一方面会使多糖部分水解,另一方面可能会溶出部分杂质,反而不利于多糖提取。因此,选最佳水浴时间为2.5 h。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据Box-Behnken组合设计法设计,实验共有17组,12个析因点及5个区域的中心点,以多糖得率为响应值[15]。实验设计及结果如表2所示。

表3 回归模型方差分析结果

注:p<0.001表示有极显著的影响,用**表示;p<0.05表示有显著的影响,用*表示。

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 响应面结果分析 利用Design-Expert软件对表2中的数据进行多元二次响应面回归方程拟合,得多元二次回归模型:Y=14.65+0.34A-0.043B+0.75C-0.56AB+0.68AC-0.26BC-1.68A2-0.67B2-1.80C2,对回归模型进行方差分析,结果见表3。

2.2.3 响应面分析图 可根据响应面的陡峭程度来说明随着各因素的变化多糖得率的变化情况,从等高线的形状可以判断出交互作用的强弱及影响作用的大小,椭圆表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反[16-18]。

由图6可知,料液比、水浴温度、水浴时间两两之间的交互作用对黄牛肝菌多糖的提取影响都非常显著,该结果与回归分析保持一致。从图6(a)可以看出,响应曲面图开口向下,响应面陡峭,随着料液比或水浴温度的增加,多糖的得率都先增加,达极大值后减小,这与单因素结果保持一致。从图6(b)可知,水浴时间曲线比液料比的曲线较陡,表明水浴时间对实验结果的影响大于液料比的显著性。由图6(c)可知,当水浴时间一定时,多糖得率随水浴温度的增加而增加,表面水浴温度对多糖提取率呈正相关性。对三组图比较可知,水浴时间对黄牛肝菌多糖提取率的影响最为显著,表现为曲线较陡,液料比的影响较为显著,而水浴温度的影响不显著,表现为曲线较为平滑。

图6 各两因素交互作用对黄牛肝菌多糖得率影响的响应曲面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of extraction rate

2.2.4 响应面分析检验 根据上述响应面优化得到黄牛肝菌多糖的最佳提取条件为:微波功率350 W,微波时间70 s,51.62∶1(mL/g),水浴温度78.43 ℃,水浴时间2.60 h,多糖得率的预测值为14.77%。考虑实际操作条件,将最佳提取工艺条件修正为:微波功率350 W,微波时间70 s,液料比52∶1(mL/g),水浴温度78 ℃,水浴时间2.60 h。进行3次平行验证实验,在此条件下,黄牛肝菌多糖的平均得率为14.74%,与预测值的相对误差为0.35%。充分说明了采用响应面优化提取多糖的条件准确可靠,具有一定的生产指导作用,可用于黄牛肝菌多糖的提取。

2.3 黄牛肝菌多糖抗氧化测定结果

2.3.1 DPPH自由基清除活性 由图7可知,随多糖及VC浓度增大,清除率也增大,多糖对DPPH自由基的清除能力与浓度成正比关系,当浓度大1000 μg/mL时,清除率达21.5%,而VC的清除率达77.5%,相比较而言,VC对DPPH自由基的清除能力强于黄牛肝菌多糖,原因可能是黄牛肝菌粗糖杂质含量较多,对DPPH自由基的清除不利。

图7 多糖和VC对DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharides and VC on DPPH·

2.3.2 OH·清除活性 由图8可知，当浓度从62.5～1000 mg/mL时,多糖和VC对OH·清除率均随着质量浓度增大而升高。当多糖浓度达到1000 mg/mL时,多糖对羟基自由基的清除率为26.5%,而VC清除率达90.1%,可见黄牛肝菌多糖对OH·的清除能力明显低于VC。

图8 多糖和VC对·OH的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharides and VC on·OH

3 结论与讨论

采用微波辅助法,在单因素的基础上,应用响应面法优化了黄牛肝菌中多糖的提取工艺,当微波功率为350 W,微波时间为70 s,液料比52∶1(mL/g),水浴温度为78 ℃,水浴时间2.60 h时提取工艺最佳。在此条件下,测得黄牛肝菌多糖的平均得率为14.74%。与预测值的相对误差为0.35%,说明采用响应面优化法具有可行性和实用价值,该方法是一种提取黄牛肝菌多糖的有效方法。与文献[7,19-20]报道的大多数牛肝菌得率相比,本研究所提取的黄牛肝菌多糖得率相对较高,但低于王心诗[21]等所报道的野生铜色牛肝菌多糖得率(14.92%)。原因可能是由于不同的菌属及不同的自然环境会对野生菌多糖的含量产生影响,同时,不同的提取方法对多糖的提取效果也有一定影响。黄牛肝菌多糖对OH·和DPPH自由基都有一定的清除作用,且具有量效关系。本研究进行为云南地方黄牛肝菌资源的进一步重视和开发提供了一定实验指导。

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A research based on response-surface method for optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharides fromBoletusauripesPk. and its antioxidation

LI Li,LI Ling,LIU Meng-jiang,SU Peng

(Department of Resource and Environment,Baoshan College,Baoshan 678000,China)

In this research,microwave-assisted method was used to extract polysaccharides fromBoletusauripesPk. of Yongren area in Yunnan and this technology was optimized by response surface method. Based on single-factor experiment,three-factor and three-level central composite design was conducted with certain liquid-solid ratio,water bath temperature and time. Meanwhile,its scavenging effect on DPPH free radical and OH· was investigated. The optimal extraction processes as follows:1iquid-solid ratio at 52∶1(mL/g),water bath temperature of 78 ℃,water bath time for 2.60 h,microwave time in 70 s and microwave power at 350 W. It was found that polysaccharide yielded was up to 14.74% compared with theoretical value(14.77%),the relative error was at 0.35%. Furthermore,it had certain scavenging effect on DPPH free radical and OH·,which became larger with the increase of its concentration.

BoletusauripesPk.;polysaccharide;microwave-assisted;response surface method;antioxidation

2016-07-25

李丽(1982-)，女，硕士，讲师，研究方向：天然产物提取，E-mail:lili19820607@126.com。

2015年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目(201510686002)；保山科技局2016年市级科技计划项目(2016bs101)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)06-0293-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.047