Box-Benhnken响应面优化银杏叶总黄酮提取物泡腾片的制备及其质量分析

王京龙,郑丹丹,张立华,王 飞,王占一,楚文超

(1.枣庄学院生命科学学院,山东枣庄 277160;2.郑州大学药学院,河南郑州 450001)

Box-Benhnken响应面优化银杏叶总黄酮提取物泡腾片的制备及其质量分析

王京龙1,郑丹丹1,张立华1,王 飞1,王占一1,楚文超2

(1.枣庄学院生命科学学院,山东枣庄 277160;2.郑州大学药学院,河南郑州 450001)

为制备银杏叶总黄酮提取物泡腾片剂,本文以崩解时限、pH为评价指标,采用Box-Benhnken响应面实验优化泡腾崩解剂配比(碳酸氢钠:柠檬酸)、泡腾崩解剂总质量、聚乙二醇6000用量,并通过片剂重量差异、崩解时限、pH、发泡量、总黄酮的含量,对产品进行质量控制。结果表明,泡腾崩解剂最佳配比为1∶1.21,泡腾崩解剂的总量最佳质量分数为46.15%,PEG 6000的最佳质量分数为6.02%。最优工艺条件下制备的泡腾片,平均片重(500±21) mg,每片总黄酮含量为(4.80±0.08) mg,崩解时限、pH和发泡量符合药典规定,制备的银杏叶提取物泡腾片外观良好,崩解迅速,溶解后溶液澄清透明、呈弱酸性。

银杏叶提取物,泡腾片,Box-Benhnken响应面实验,制备工艺,质量分析

银杏(GingkobilobaL.)又叫做公孙树、白果,是我国特有物种。2015年版《中国药典》中记载,银杏叶具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂的功效[1]。同时,银杏叶也常被加工成泡茶饮用,属于“药食同源”的范畴。银杏叶的活性成分主要包括黄酮类、萜内酯类、多糖类、有机酸类等[2]。目前从银杏叶中分离的黄酮类化合物有40多种,根据分子结构不同可分为黄酮、黄酮醇及其苷、双黄酮和儿茶素等几大类,其中黄酮(醇)苷类是主要活性成分[3]。同时,银杏叶黄酮具有抗氧化[4]、保护心脑血管[5]、保肝[6-7]、抗肿瘤[8-9]等生理活性。

相对于传统制剂,泡腾片具有分散快速,生物利用度高的优点[10-11],同时口感适宜,服用顺从性好。目前,针对银杏叶开发的药品或保健食品主要有普通片剂、分散片、口服液、颗粒、丸剂、胶囊剂、注射液以及茶剂等[12],还未见有将银杏叶开发成泡腾片的专利报道。而且,有关银杏叶泡腾片制备工艺优化的文献较少,仅有胡林水等人采用正交实验对枸橼酸、碳酸氢钠用量以及是否采用聚乙二醇包裹进行考察[13]。

Box-Behnken中心组合设计通过二次多项式或更高次项的模型拟合,能同时进行线性、两因素相互作用考察,从而更直观、准确地优化得到最佳工艺条件[14]。本研究首次采用Box-Benhnken响应面优化法[15-16],以柠檬酸和碳酸氢钠用量比例,总量以及PEG6000的量为考察因素,对银杏叶泡腾片的制备工艺进行优化,制定工艺参数,以期制备出口感良好、食用方便、起效迅速、具有一定保健功效植物源保健品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏叶 安徽亳州中药饮片公司;芦丁(批号:100080-201409) 中国食品药品检定研究院;柠檬酸、碳酸氢钠、无水乙醇 天津市福晨化学试剂厂;聚乙二醇6000、甘露醇、乳糖 天津市风船化学试剂科技有限公司;亚硝酸钠等试剂 均为分析纯。

UV-4802双光束紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;PHS-3C pH计、FA1104电子分析天平 上海仪电科学仪器股份有限公司;DHG-9246A电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;VH-2精品实验用混合机 常州市龙湖干燥工程有限公司;YK60小型实验室颗粒机 长沙市楚泰制药机械设备有限公司;2P-5A旋转式压片机 青州市精诚医药装备制造有限公司;片剂四用测定仪 上海黄海药检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏叶提取物的制备 准确称取银杏叶粉45.0 g,8%氢氧化钠溶液调节pH至10,回流提取(温度95 ℃,料液比1∶40,煎煮时间60 min),粗滤,4000 r·min-1离心25 min,上清液用稀盐酸调节pH至3.5,静置24 h抽滤,沉淀物水洗至中性[17],60 ℃烘箱中烘干得干浸膏,研磨过80目筛,即得银杏叶总黄酮提取物(总黄酮质量分数为22.32%)。

1.2.2 银杏叶提取物泡腾片的制备工艺 称取PEG6000适量,60 ℃左右恒温水浴锅中水浴融化,加入处方量碳酸氢钠,快速搅拌直到完全熔融,冷却后变成固体,研磨,过80目筛制成分散体。采用湿法制粒将分散体、柠檬酸、银杏叶提取物、乳糖/甘露醇(8∶1)按照处方混合均匀,以95%乙醇作为粘合剂制软材,制粒,颗粒在50 ℃左右烘干,20目筛整粒,控制空气相对湿度在30%以下,进行颗粒压片。

1.2.3 银杏叶提取物泡腾片处方优化单因素实验 银杏叶片收载于《中国药典》2015年版一部,规定每片含总黄酮不少于9.6 mg,参照此标准,结合本实验泡腾片的质量(规格:0.5 g),模拟计算可知,固定银杏叶提取物在处方中的比例为4.3%,每2片银杏叶泡腾片可相当于1片普通银杏叶片来使用。

为优化泡腾片制备工艺,固定银杏叶提取物的质量分数4.3%,以泡腾片崩解时限、pH作为评价指标,考察泡腾崩解剂配比、泡腾崩解剂质量分数、PEG 6000用量三个因素对泡腾片质量的影响。另外,选择乳糖与甘露醇作为稀释剂,二者的吸湿性都较低,同时,在本制剂中银杏叶提取物有苦味,可以起到矫味的作用。由于甘露醇具有较强的利尿作用,不宜过多,所以在实验中选择乳糖和甘露醇的比例为6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1进行优化,结果在乳糖∶甘露醇为8∶1时,口感、泡腾效果最好。

1.2.3.1 泡腾剂碱酸比单因素实验 固定泡腾崩解剂质量分数为45%,PEG 6000用量6%,选择碳酸氢钠∶柠檬酸质量比为1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4,按1.2.2项下方法制备银杏叶泡腾片,测定其崩解时限、溶解后溶液的pH(n=3),以筛选泡腾剂的酸碱比。

1.2.3.2 泡腾崩解剂总质量单因素实验 同法,固定碳酸氢钠:柠檬酸质量比为1∶1.2,PEG6000用量6%,选择崩解剂质量分数为30%、35%、40%、45%、50%,按1.2.2项下方法制备银杏叶泡腾片,筛选泡腾崩解剂的总质量。

1.2.3.3 PEG6000用量单因素实验 同法,固定碳酸氢钠:柠檬酸质量比为1∶1.2,泡腾崩解剂质量分数为45%,选择PEG 6000用量为2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%,筛选PEG 6000用量。

1.2.4 响应面法优化银杏叶泡腾片制备工艺 结合单因素实验结果,选择泡腾崩解剂配比、泡腾崩解剂总质量、PEG6000用量三个因素作为Box-Benhnken设计中的考察对象,以崩解时限为评价指标,对泡腾片的处方进行优化,实验因素和水平见表1。

表1 Box-Benhnken实验设计因素水平

1.2.5 工艺验证 按1.2.4项下所得优化工艺条件制备泡腾片3批,以崩解时限为指标进行工艺验证。

1.2.6 银杏叶提取物泡腾片的质量分析

1.2.6.1 重量差异测定 取自制泡腾片20片,精密称定重量,超出片重差异限度的不得多于2片,并不得有1片超出限度1倍。

1.2.6.2 崩解时限的测定 取本品1片,置于盛有200 mL温水(约20 ℃)的烧杯中,待片剂周围气体停止逸出时,片剂应在5 min内溶散完全无残留(n=6)。

1.2.6.3 pH测定 取泡腾片6 片,分别分散于100 mL、20 ℃蒸馏水中,测定各溶液的pH。

1.2.6.4 发泡容量检查 采用质量损失法,取泡腾片1片,研磨,精密称取片粉适量(1 g左右),置于已精密称质量的含水烧杯中,待其发泡完全,再精密称定烧杯及溶液总质量,计算CO2的体积(n=6)。CO2气体生成越多,此配方泡腾效果就越好。

1.2.6.5 泡腾片中总黄酮的含量 制备0.20 mg/mL的芦丁对照品溶液,再精密量取1、2、3、4、5、6 mL,置25 mL容量瓶中,分别加水至6 mL,加入5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀后静置5 min;加入10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀后静置6 min;加入4%氢氧化钠溶液10 mL,用蒸馏水定容至刻度,摇匀后静置15 min显色。同法制备空白对照溶液,立即在500 nm波长下用紫外-可见分光光度计测定吸光度[18],并以吸光度(A)为纵坐标,芦丁浓度(C)为横坐标,进行线性回归,得回归方程A=11.261C-0.0135(R2=0.9980)。

称取自制泡腾片20片,捣碎,取1.5 g粉末,95%乙醇溶液溶解,摇匀,定容至100 mL,作为供试品溶液。精密吸取供试液5 mL,同法测定,计算银杏叶泡腾片中总黄酮的含量。

1.3 统计分析方法

使用SPSS 20.0数据统计软件对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 银杏叶提取物泡腾片处方优化单因素实验结果

2.1.1 泡腾剂配比单因素实验结果 预实验中,对酸源(柠檬酸、酒石酸、富马酸)进行了初步筛选,酒石酸所制泡腾片泡腾效果较好,但泡腾后的水溶液易显浑浊或沉淀,影响色泽观感和口感;富马酸所制泡腾片泡腾效果不好,崩解时限最慢;相比前二者,柠檬酸的泡腾效果较佳,口感、色泽也较好。表2为泡腾剂配比对片剂崩解时限和pH的影响,结果显示,当碳酸氢钠∶柠檬酸质量比为1∶1.2时,泡腾片崩解时限最短。口感方面,如果碱源比例过大,泡腾片溶液容易发涩,酸源比例过大,pH太小,也不利于口感。综合考虑,选取泡腾崩解剂配比在1∶1.0～1∶1.4范围内进行响应面实验。

表2 泡腾剂配比对片剂崩解时限和pH的影响

2.1.2 泡腾崩解剂总质量单因素实验结果 表3为泡腾剂总量对片剂崩解时限和pH的影响,结果显示,当崩解剂总质量分数在45%时,泡腾片崩解时限最短,崩解剂总质量分数对pH的影响不大。综合考虑,选取泡腾崩解剂配比在40%～50%范围内进行响应面实验。

2.1.3 PEG 6000用量单因素实验结果 在制粒压片过程中,PEG 6000用量为2%、3%、4%时制成的颗粒较松散,压片不易成片;PEG 6000用量为8%时,由于PEG 6000用量较多,所形成的分散体呈块状不易研磨,易造成损失。PEG 6000用量为6%时,泡腾片崩解时限最短。综合考虑,PEG 6000质量分数在5%～7%范围内进行响应面实验。

表3 泡腾剂总量对片剂崩解时限和pH的影响

表4 PEG6000用量对片剂崩解时限和pH的影响

为了提高泡腾片的稳定性,在制备银杏叶泡腾片过程中采用PEG 6000包裹碳酸氢钠的方法制备分散体。在实验过程中曾实验用PEG 6000包裹柠檬酸用于减少碳酸氢钠和柠檬酸的接触,但是PEG 6000与柠檬酸混合后出现低共融现象,二者一起熔融后不能冷却成固体。

2.2 Box-Benhnken设计响应面实验结果

在进行单因素实验时,选取了pH和崩解时限作为双重评价指标,但结果显示,除碱源和酸源的比例对pH影响较大外,另外两个因素的变化对pH的影响不具有显著性,进行响应面实验设计时,如果将pH作为考察指标,二次回归和多次回归拟合意义不大。而且,《中国药典》中,对泡腾片水溶液的pH并没有明确规定,本实验中,通过单因素实验发现,pH在4.40～6.16之间,符合弱酸性要求,同时能保证口感。所以,只选择崩解时限作为指标进行回归分析。

以泡腾崩解剂总质量分数(%)、碳酸氢钠∶柠檬酸的比例、PEG6000用量为考察因素,应用Box-Benhnken设计三因素三水平的实验,以泡腾崩解时限作为评价指标对泡腾片制备工艺进行优化,实验结果见表5。

表5 Box-Benhnken设计表及结果

对响应值和各因素进行回归拟合,得到回归方程如下:Y=65.20-2.62X1-3.75X2+0.13X3+1.00X1X2+0.25X1X3-1.50X2X3+17.27X12+8.02X22+5.28X32,相关系数R2=0.9663,说明因变量和自变量之间线性关系显著,方程拟合度好。由表6可知,模型F值为22.28,p=0.0002<0.05,表现为极显著;失拟项p=0.1274>0.05,表现为不显著,说明模型精度高,能很好的对响应面进行预测,适用于银杏叶泡腾片制备工艺优化分析。

表6 响应面实验方差分析

注:**表示影响极显著(p<0.01),*表示影响显著(p<0.05)。

由表6可知,3个因素对泡腾片质量的影响顺序为泡腾崩解剂总量>泡腾崩解剂配比>PEG6000用量,X1、X2、X32影响显著(p<0.05),X12、X22的影响极显著(p<0.05),但泡腾崩解剂总量、泡腾崩解剂配比以及PEG6000用量之间交互作用不显著。

2.3 影响因素的响应面曲线图

交互作用的响应面曲线图能直观地反映各因素对响应值的影响,在所选的范围内分析响应面的最低点可以看出有最优值存在,曲面图中若曲面坡度陡峭,表示两个因素结合在一起对实验结果影响较大,相反表示影响较小。从三组响应面图1可知,曲线图中崩解时限随泡腾崩解剂配比(X1)的变化而变化,而PEG6000(X3)用量对曲线图变化几乎无影响,同时泡腾崩解剂总质量(X2)对曲线图变化影响较小,所以X1X3两因素交互作用几乎不存在,X1X2两因素交互作用较小。图1的曲线图中崩解时限随泡腾崩解剂总质量(X2)的变化而变化,同时PEG6000(X3)用量对曲线图变化影响较大,所以X2X3两因素存在交互作用;综合分析上述三组图可知,因素之间交互作用大小为X2X3>X1X2>X1X3。响应面优化实验得出最优条件为:泡腾崩解剂配比(碳/柠)1∶1.21、泡腾崩解剂总量46.15%、PEG6000用量6.02%,此条件下模型预测泡腾片崩解时限为79.67 s。

图1 各因素交互作用对崩解时限的影响曲面图Fig.1 The response surface figure of three factors interaction effect on disintegration time limit

按所得最佳工艺条件制备银杏叶提取物泡腾片3批,进行工艺验证,测得崩解时限为(79.14±1.24) s。经过数据分析,所得方程拟合度高,因素影响显著性高,银杏叶提取物泡腾片的崩解时限预测值79.67 s,验证实验结果显示,其崩解时限79.14 s,与预测值接近,数据模型合理、可信。

2.4 银杏叶总黄酮提取物泡腾片的质量分析

采用本工艺制备的银杏叶提取物泡腾片,外观整洁,冲泡后所得溶液澄清透明,口感佳。平均片重为(500±21) mg,未发现片重超限,全部在5 min内崩解,符合《中国药典》2015年版的相关规定。所得溶液均呈弱酸性,1 g泡腾片粉平均可产生CO2气体(10.25±0.22) mL(RSD=2.14%)。按1.2.6.5项下方法求得,银杏叶提取物泡腾片中总黄酮的含量为(4.80±0.08) mg/片(RSD=1.67%),每片按0.5 g计算。模拟设计给药方案,每天3次,每次2片,可以达到市场上销售的银杏片总黄酮当量。

3 结论

本研究旨在将银杏叶进行二次开发,制备成口感好,易吸收的泡腾片剂。泡腾崩解剂最佳配比为1∶1.21,泡腾崩解剂的总量最佳质量分数为46.15%,PEG 6000的最佳质量分数为6.02%。最优工艺条件下制备的泡腾片,平均片重(500±21) mg,每片总黄酮含量为(4.80±0.08) mg,崩解时限、pH和发泡量符合药典规定,制备的银杏叶提取物泡腾片外观良好,崩解迅速,溶解后溶液澄清透明、呈弱酸性。

目前,银杏叶被广泛开发成药品或保健食品,用于心脑血管疾病病人的治疗或养生与保健。本研究将银杏叶中的总黄酮提取物开发成了口感好,利于服用的泡腾片,具有良好的市场前景。在以后的工作中,还应在体内药代动力学方面[19-20]和药效学等方面继续深入研究,并与现有制剂比较,以考察本研究所制备泡腾片在生物利用度和药效方面的优势。

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Preparation ofGinkgobilobaleaves flavonoids extract effervescent tablets with Box-Benhnken response surface experiments and its quality analysis

WANG Jing-long1,ZHENG Dan-dan1,ZHANG Li-hua1,WANG Fei1,WANG Zhan-yi1,CHU Wen-chao2

(1.College of Life Sciences,Zaozhuang University,Zaozhuang 277160,China;2.Department of Pharmacy,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

To prepareGinkgobilobaleaves extracts effervescent tablets,Box-Benhnken response surface experiments was used to optimize the formulation,including the usage of matrix(polyethylene glycol 6000,PEG 6000),the proportion and amount of effervescent agent(sodium bicarbonate and citric acid),with pH value and disintegration time limit as the evaluation index. Then the optimized effervescent tablets were analyzed by main drug content,frothing volume,pH value,disintegration time limit and the weight variation. The optimum proportion of effervescence disintegrants(sodium bicarbonate,citric acid)was 1∶1.21,the mass fraction of effervescence disintegrants was 46.15%,and mass fraction of PEG 6000 was 6.02%. The average weight of the tablets was(500±21) mg,and the content of flavonoid was(4.54±0.08) mg. The disintegration time,pH and foaming quantity also meet the requirements of pharmacopoeia. The obtained effervescent tablets displayed good appearance,rapid disintegration,clear solution and no precipitation.

Ginkgobilobaextracts;effervescent tablets;Box-Benhnken response surface experiments;preparation;quality analysis

2016-08-16

王京龙(1988-)，男，博士，讲师，研究方向：中药新药研发与中药炮制原理，E-mail：jlwang8121@163.com。

山东省自然科学基金项目(ZR2013BL018)。

TS202.1

B

1002-0306(2017)06-0288-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.046