牛磺酸和FK506对HepG2细胞胆固醇水平的影响

曹雪莲,赵玉星,郭俊霞,张 静,陈 文

(北京联合大学生物化工学院食品科学系,北京 100023)

牛磺酸和FK506对HepG2细胞胆固醇水平的影响

曹雪莲,赵玉星,郭俊霞,张 静,陈 文*

(北京联合大学生物化工学院食品科学系,北京 100023)

目的:以总胆固醇(Total cholesterol,TC)、游离胆固醇(Free cholesterol,FC)和胆固醇酯(Cholesterol ester,EC)为评价指标,探讨牛磺酸对FK506诱导肝癌细胞HepG2细胞胆固醇水平代谢异常的影响。方法:首先建立损伤模型,加终浓度为1、5和10 μg/mL的FK506,分别在培养24、48 h后测定细胞存活率以及胞内TC、FC和EC水平,确定FK506处理的终浓度;在此基础上,再添加终浓度为0.1、1、10和20 mmol/L的牛磺酸,分别培养24、48 h,测定细胞内TC、FC和EC水平。结果:培养24、48 h,5和10 μg/mL FK506处理都使细胞TC、FC水平明显升高(p<0.05),EC水平没有明显变化,但10 μg/mL FK506作用48 h时,细胞存活率显著下降到70%,因此确定FK506处理的终浓度为5 μg/mL。在FK506(5 μg/mL)预处理 6 h后,0.1、1、10和20 mmol/L的牛磺酸作用24、48 h都可显著降低FK506诱导的细胞TC、FC水平升高(p<0.05),但作用24 h的效果优于48 h,以20 mmol/L作用24 h降胆固醇效果最佳。结论:FK506通过增加FC诱导HepG2细胞胆固醇水平升高,而牛磺酸通过降低FC改善了细胞高胆固醇水平。

牛磺酸,FK506,胆固醇,HepG2细胞

牛磺酸(Taurine)又称2-氨基乙磺酸,是一种含硫的非蛋白氨基酸,主要存在于哺乳动物的大脑、心肌、肝脏、肌肉、肾脏等组织中,并且具有多种生理功能[1-3]。多年来,大量动物实验证明牛磺酸可以降低高胆固醇血症大鼠、小鼠、豚鼠的血清胆固醇水平[4-7],临床实验也显示牛磺酸能有效降低志愿者的血清总胆固醇与动脉粥样指数,从而降低心脑血管疾病的风险[8-9]。

FK506通用名为他克莫司,属于钙调蛋白磷酸酶抑制剂,是器官移植领域广泛应用的一种免疫抑制剂[10]。临床应用表明其能延长肝肾移植患者的存活时间,药效是环孢素A的10～100倍,但却有诱发高脂血症的副作用[11-12]。有实验表明,肾移植后患者血脂异常发生率较普通人群增高60%～80%[13]。有文献报道FK506可致肝脏损害、糖尿病等多种代谢紊乱[14-15]。而牛磺酸广泛存在于机体的组织器官中,具有护肝降脂作用[16],但目前未见有关于牛磺酸对FK506引起的胆固醇代谢紊乱影响的报道。

本实验以HepG2细胞为实验对象,利用不同浓度的FK506作用于HepG2细胞,探讨了FK506对细胞胆固醇水平的影响;并在此基础上初步探讨了牛磺酸对FK506处理的HepG2细胞胆固醇水平的影响,为开发具有降胆固醇作用的特殊医学用途的食品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

HepG2细胞 中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心;DMEM培养基 美国HyClone公司;胎牛血清(FBS) 美国Gibco公司;胆固醇(纯度≥99%)、牛磺酸(纯度>99%)、FK506水合物(纯度≥98%)、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶、胆固醇酯水解酶、水合牛胆酸钠、4-氨基安替比林、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT) 美国Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

uQuant Bio-Tek酶标仪 美国Bio-Tek公司。

1.2 FK506浓度对HepG2细胞存活率和胆固醇代谢的影响

HepG2细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37 ℃、5% CO2恒温培养。以2×104～4×104/孔接种于96孔板中,分别加入终浓度为1、5和10 μg/mL的FK506溶液,培养24 h或48 h,弃旧培养液,加入MTT浓度为0.5 mg/mL的DMEM培养基(200 μL/孔),继续培养4 h。弃上清液,每孔加入200 μL DMSO,摇床轻微振荡10 min,紫色结晶完全溶解后,酶标仪562 nm读取吸光度值,以正常对照为100%,计算细胞存活率。

以1×105～2×105个/孔接种于六孔板中,分别加入终浓度为1、5和10 μg/mL FK506培养24、48 h,测定细胞胆固醇。

1.3 牛磺酸对FK506诱导HepG2细胞胆固醇水平代谢异常的影响

以1×105～2×105个/孔接种于六孔板中,根据FK506和牛磺酸对细胞存活率影响的结果,确定实验中FK506和牛磺酸的浓度,将细胞分为正常对照组(N)和FK506处理组(FK),在FK506处理6 h后,分别加入0.1、1、10和20 mmol/L牛磺酸为牛磺酸组(T),继续培养24 h或48 h,测定细胞内胆固醇。

1.4 细胞内胆固醇水平测定

细胞每孔加入1 mL正己烷-异丙醇(2∶1,V/V)冰上慢摇60 min以提取细胞内脂类物质;4 ℃、10000 r/min离心10 min,上清液通氮气40 min除去有机溶剂;以含10% TritonX-100异丙醇130 μL振荡溶解上述脂类提取物。按照表1配制总胆固醇(Total cholesterol,TC)和游离胆固醇(Free cholesterol,FC)测定工作液。取50 μL脂类提取物,分别加入TC和FC测定工作液,37 ℃水浴30 min,用酶标仪于500 nm波长处测定吸光度[17-18],绘制标准曲线,计算TC、FC含量,胆固醇酯(Cholesterol ester,EC)=TC-FC。

细胞提取脂类物质后加入裂解液冰上提取细胞内总蛋白,采用BCA试剂盒测定蛋白质含量。

胆固醇相对含量(μg/mg·pro)=胆固醇/总蛋白质。

表1 胆固醇测定工作液配制成分

1.5 数据处理

实验数据以平均值±标准差(X±S)表示,经SPSS统计软件进行ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 FK506对HepG2细胞存活率的影响

由图1可知,处理时间为24 h时,三个剂量FK506组与对照组相比,细胞活力均无显著性差异(p>0.05)。处理时间为48 h 时,细胞活力与FK506浓度呈负相关关系,且10 μg/mL FK506使细胞存活率显著下降(p<0.05)。以上结果表明,随着浓度以及作用时间的增加,FK506对细胞活力的抑制程度增加。

图1 FK506作用24 h和48 h对HepG2细胞活力的影响Fig.1 Effect of FK506 on the viability of HepG2 cells for 24 h and 48 h注:N正常对照组;FK1、FK5、FK10的终浓度为1、5和10 μg/mL。*:与正常对照组相比,p<0.05，图2、图3同。

2.2 FK506对HepG2细胞胆固醇水平的影响

由图2可知,加入HepG2细胞培养24 h,1 μg/mL FK506对细胞内胆固醇(TC、FC和EC)水平无显著影响(p>0.05);5 μg/mL和10 μg/mL FK506使胞内TC水平分别升高了21.6%和25.0%(p<0.05),使胞内FC水平分别显著增加了28.1%和30.6%(p<0.05),但对细胞内EC水平均无显著影响。

图2 FK506作用24 h对HepG2细胞胆固醇水平的影响Fig.2 Effect of FK506 on intracellular cholesterol levels after 24 h culture

由图3可知,FK506作用于HepG2细胞48 h,对细胞内胆固醇的影响与作用24 h相似。5 μg/mL FK506使胞内TC显著增加21.7%(p<0.05),而10 μg/mL FK506可使胞内TC和FC都明显升高(18.7%和22.2%)(p<0.05)。在1～10 μg/mL范围内,FK506对胞内EC水平均无显著影响。

图3 FK506作用48 h对HepG2细胞胆固醇水平的影响Fig.3 Effect of FK506 on intracellular cholesterol levels after 48 h culture

综合FK506作用时间和浓度对HepG2细胞存活率影响的考虑,确定后续实验中FK506处理终浓度为5 μg/mL。

2.3 牛磺酸对FK506诱导HepG2细胞胆固醇代谢异常的影响

预实验结果显示,牛磺酸单独作用48 h,当终浓度达到20 mmol/L时,细胞的存活率约为88%,与对照组无显著性差异(p>0.05),终浓度达到30 mmol/L时,细胞的存活率显著降低至70%,故本实验中将牛磺酸的最大浓度设为20 mmol/L。HepG2细胞加入5 μg/mL FK506预处理后,分别加入不同浓度牛磺酸(0.1、1、10和20 mmol/L)孵育24 h。由图4可知,单独添加5 μg/mL FK506可使细胞内TC和FC含量显著升高(p<0.05)。在此基础上,牛磺酸(0.1、1、10和20 mmol/L)可显著降低细胞TC水平(p<0.05),随着牛磺酸浓度升高TC下降幅度增大,呈剂量依赖关系,10和20 mmol/L牛磺酸使胞内TC减少达16.7%和22.7%。并且由图可知牛磺酸主要是降低细胞内FC水平,对EC水平无明显影响。

图4 牛磺酸作用24 h对FK506诱导的HepG2细胞胆固醇水平的影响Fig.4 Effects of Taurine on abnormal cholesterol metabolism in HepG2 cells induced by tacrolimus for 24 h注:T0.1、1、10、20牛磺酸分别为0.1、1、10和20 mmol/L。#:与正常对照比较差异显著，p<0.05;*:与FK506处理组比较差异显著,p<0.05；图5同。

由图5可知,处理时间为48 h时,5μg/mL FK506可使细胞内TC显著升高(p<0.05)。在此基础上,0.1、1、10和20 mmol/L牛磺酸显著降低细胞TC水平(p<0.05),降低幅度分别为10.9%、12.5%、12.4%、14.1%,且主要通过减少细胞内FC而降低胆固醇水平。

图5 牛磺酸作用48 h对FK506诱导的HepG2细胞胆固醇水平的影响Fig.5 Effects of Taurine on abnormal cholesterol metabolism in HepG2 cells induced by tacrolimus for 48 h

3 讨论

关于FK506对细胞存活率的影响,Francesca Capone等人[19]研究表明,处理48 h后,0.72 μmol/L FK506对HepG2细胞的致死率达到50%。Navarro-Villarán E等人[20]的体外实验结果显示,100 μmol/L FK506可诱导HepG2细胞凋亡。高金亭等人[21]报道,FK506在24 h内对肝癌细胞无明显作用,但在72 h随剂量增加,可抑制细胞增殖。本实验中,处理时间为24 h时,1 μg/mL FK506对细胞存活率无影响,而10 μg/mL使细胞存活率降至82%。当处理时间为48 h,1和5μg/mL FK506使细胞存活率降为89%和81%,10 μg/mL FK506则使细胞存活率下降显著。提示随着FK506作用时间和浓度的增加对细胞增殖的抑制明显增强。

到目前为止,大量体内和体外实验都表明牛磺酸具有降胆固醇的作用[22],但未见有关于牛磺酸影响FK506引起的细胞胆固醇水平升高的报道。本实验中,在FK506诱导的高胆固醇实验模型基础上,0.1、1、10和20 mmol/L牛磺酸处理24 h和48 h均可显著改善细胞TC水平的升高(p<0.05)。同时结果提示,细胞培养48 h后,牛磺酸降胆固醇的作用与培养24 h时相比有所减弱,10和20 mmol/L降胆固醇幅度分别从16.7%、22.7%下降到12.4%、14.1%,这可能与FK506作用时间长对细胞毒性增大有关,因为MTT实验结果显示,5 μg/mL FK506处理24 h,细胞相对存活率为94%,而处理48 h,细胞的存活率下降为81%。

胆固醇转化成胆汁酸是机体胆固醇降解的一个重要途径,是调节体内胆固醇平衡的重要因素[7]。目前的研究显示,牛磺酸主要是从提高血液循环中胆固醇的清除、促进肝脏胆固醇向胆汁酸的生物转化、增加粪便胆汁酸的排出等多方面发挥降胆固醇的作用[22]。本实验中初步明确了牛磺酸能够降低FK506引起的HepG2细胞内胆固醇水平的升高,但关于其发挥作用的途径与机制有待于进行深入的研究。

4 结论

FK506可诱发HepG2细胞胆固醇代谢紊乱,并且主要是升高FC水平,对EC无显著影响。而牛磺酸通过降低细胞内FC改善了细胞高胆固醇水平,以20 mmol/L作用24 h降胆固醇效果最佳。在今后的研究中,应重点探究牛磺酸发挥降胆固醇作用的分子机制。

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Effect of Taurine and FK506 on cholesterol levels in HepG2 cells

CAO Xue-lian,ZHAO Yu-xing,GUO Jun-xia,ZHANG Jing,CHEN Wen*

(College of Biochemical Engineering,Beijing Union University,Beijing 100023,China)

Objective:The aim of present study was to investigate the effects of Taurine on abnormal cholesterol metabolism in HepG2 cells induced by tacrolimus with total cholesterol(TC),free cholesterol(FC)and cholesterol ester(EC)as the evaluation indexes. Methods:Cell survival rate and the levels of intracellular TC,FC,EC were detected after the cells were cultured for 24 and 48 h in DMEM supplemented with FK506 at final concentrations of 1,5,10 μg/mL,respectively. The concentration of FK506 was determined which was used to test cholesterol lowering effect of Taurine. Then,Taurine was added to the DMEM with final concentration of 0.1,1,10 and 20 mmol/L after the cells were cultured with FK506 for 6 h and the levels of intracellular TC,FC and EC were detected after the further incubation for 24 and 48 h. Results:The levels of intracellular TC and FC but not EC were significantly increased after the cells were cultured in the presence of 5 and 10 μg/mL FK506 for 24 h and 48 h(p<0.05),but 10 μg/mL FK506 for 48 h resulted in cell survival rate decreased to 70% significantly. Therefore,5 μg/mL FK506 was selected as the treatment dose in the following experiments. With the FK506(5 μg/mL)pretreatment for 6 h,Taurine(0.1,1,10 and 20 mmol/L)supplementation for 24 and 48 h could significantly reduced the evaluated TC,FC levels in cells induced by the FK506(p<0.05),and showing a superior effect at 24 h than at 48 h. 20 mmol/L Taurine showed the best cholesterol lowing effect after 24 h treatment.Conclusion:FK506 increased the cholesterol level of HepG2 cells by increasing FC,while Taurine reduced the high cholesterol level of cells by decreasing FC.

Taurine;FK506;cholesterol;HepG2 cells

2016-09-02

曹雪莲(1990-),女,硕士研究生,研究方向:食品营养与功能,E-mail:594892979@qq.com。

*通讯作者:陈文(1966-),女,博士,教授,研究方向:食品营养与功能,E-mail:wlchenwen@buu.edu.cn。

北京市教委科技计划面上项目(KM201511417014)；北京市自然科学基金资助项目(5142004)。。

TS201.4

A

1002-0306(2017)06-0350-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.058