响应面法优化新疆奶花芸豆α-淀粉酶抑制剂的提取工艺

于雪慧,田童童,张 建

(石河子大学食品学院,新疆石河子 832003)

响应面法优化新疆奶花芸豆α-淀粉酶抑制剂的提取工艺

于雪慧,田童童,张 建*

(石河子大学食品学院,新疆石河子 832003)

利用响应面法研究新疆奶花芸豆中α-淀粉酶(α-AI)抑制剂的提取工艺。在单因素实验的基础上,选取浸提液体积、pH、浸提时间和浸提温度作为考察因素,以α-AI抑制率作为评价指标,利用Box-Behnken中心组合方法设计四因素三水平响应面分析法,建立数学模型,从而确定最佳提取工艺为:准确称取5 g样品,添加浸提液体积200 mL,在pH3.5、43 ℃下浸提2.3 h,此条件下,α-AI的抑制率达到85.30%,与理论预测值(87.82%)基本相符。结果表明,优化得到的提取工艺稳定可行,为进一步研究和开发利用奶花芸豆奠定了基础。

奶花芸豆,α-淀粉酶抑制剂,响应面分析

α-淀粉酶抑制剂(α-Amylase Inhibitor,α-AI)是一种糖苷水解酶抑制剂[1],它主要通过抑制唾液及胰α-淀粉酶的活性,来阻碍人体所食用的淀粉及其它碳水化合物的消化和吸收,在不影响其他营养物质吸收和代谢的同时,减少糖分的摄取,降低脂肪的合成,起到降糖、减肥的作用。天然的α-淀粉酶抑制剂主要存在于植物种子的胚乳中,目前己经从小麦[2]、豆类[3-4]、野生苋属[5]、绿茶[6]等植物中分离得到α-淀粉酶抑制剂,并且在国外己将其作为减肥保健食品进行应用。

奶花芸豆(Phaseolusvulgaris)属豆科菜豆属一年生草本植物,种皮呈乳白光亮,上有鲜红色斑纹[7],在我国云、贵、川山区及东北、河北、新疆等地有较大面积种植。其中以新疆生产建设兵团第十师北屯市面积最大,现已发展成为新疆的特色豆类产品[8]。田童童[9]等人从奶花芸豆中分离纯化出了铁蛋白;李慕春[10]等人利用双波长分光光度法测定出奶花芸豆的总黄酮含量为2.79 mg/g,且对奶花芸豆发芽过程中抗氧化活性的变化进行了初步的探索[11];赵林同等人也采用ICP-OES法测定出每100 g芸豆含蛋白质23.1 g,脂肪1.3 g,碳水化合物56.9 g,钙76 mg及丰富的B族维生素[12,13]。这种难得的高钾、高镁、低钠食品[14],目前只是作为一种配料和辅助食品,精细加工产品少,附加值低,价格受市场供求变化大[15],不能保证种植农户稳定的收益,而北屯市2013年奶花芸豆的产量已达4909.61 t,如何充分利用奶花芸豆提高其附加值,已成为奶花芸豆产业发展中亟待解决的问题。为此,本文主要从新疆奶花芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂,以期为奶花芸豆新产品的研究、开发提供有益的数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

奶花芸豆(芸豆2号) 新疆生产建设兵团第十师农业科学研究所提供;α-淀粉酶(3700 U/g) 北京奥博星生物技术有限公司,生物纯;可溶性淀粉 天津市永晟精细化工有限公司,分析纯;3,5-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid,DNS) 上海蓝季科技发展有限公司,分析纯。

ZXRD-7080全自动新型鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司;RHP-600高速多功能粉碎机 浙江荣浩工贸有限公司;PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;DK-8D数显恒温水浴锅 江苏金坛市医疗仪器厂;BL-206-II高速冷冻离心机 上海安亭科技仪器厂;UVmini-1240紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 奶花芸豆中α-AI提取物的制备

1.2.1.1 奶花芸豆粉的制备 将购买的奶花芸豆筛选除杂,在室温下浸泡12 h后去皮,在40 ℃烘箱中干燥后重复粉碎、过60目筛得到奶花芸豆粉,装袋保存至4 ℃冰箱内备用。

1.2.1.2α-AI的提取方法 称取5 g的样品,加入一定量蒸馏水,恒温下混合均匀后调节提取液的pH,于适当的温度下水浴浸提一定的时间后,将提取液于10000 r/min、4 ℃的条件下离心15 min,上清液即为α-AI粗提液。用DNS比色法[16]测定其中α-AI的含量。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作 取6支试管,按表1进行编号并加入试剂,混匀后沸水浴反应5 min后,迅速流水冷却,加入10 mL蒸馏水稀释,以管1为空白对照,在535 nm下测各管的吸光值。

表1 标准曲线的制备

1.2.3 抑制率的测定α-淀粉酶液0.5 mL,加入等量的样品提取液,在37 ℃下水浴保存10 min,加入2%淀粉溶液2 mL,37 ℃水浴保存5 min后,立即加入0.5 mL 40% NaOH溶液终止反应,再加入1 mL的DNS,沸水浴5 min,冷却至室温,在535 nm波长下测定吸光度。按照下列公式计算样品提取液中α-AI的抑制百分率。

式中:A0为空白对照液的吸光度值;A1为含样品溶液的吸光度值;A2为正常酶溶液反应的吸光度值。

1.2.4α-淀粉酶抑制活力定义α-淀粉酶液0.5 mL,加入2 mL不同浓度的淀粉溶液,在37 ℃下水浴反应10 min后立即加入0.5 mL 40% NaOH溶液终止反应,再加入1 mL的DNS,沸水浴5 min,冷却至室温,以蒸馏水为空白对照,在535 nm波长下测定吸光值。

抑制活力定义:在相同条件下,1 mL抑制液抑制α-淀粉酶消耗淀粉的量(mg),为一个单位抑制活力U。比活力U/mg(蛋白)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位。计算公式如下:

式中:A1为含样品溶液的吸光度值;A2为正常酶溶液反应的吸光度值;V为加入抑制剂的毫升数;a为所得淀粉浓度标准曲线的截距。

1.2.5 单因素实验设计

1.2.5.1 浸提液体积对α-AI抑制活力的影响 准确称取5 g样品,固定pH为4.0、浸提温度为40 ℃、浸提时间3.0 h,研究浸提液体积为50、100、150、200、250、300 mL时α-AI的抑制率及比活力,重复3次实验。

1.2.5.2 pH对α-AI抑制活力的影响 准确称取5 g样品,固定浸提液体积为200 mL、浸提温度为40 ℃、浸提时间3.0 h,研究pH为2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0时α-AI的抑制率及比活力,重复3次实验。

1.2.5.3 浸提时间对α-AI抑制活力的影响 准确称取5 g样品,固定浸提液体积为200 mL、pH为4.0、浸提温度为40 ℃,研究浸提时间为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h时α-AI的抑制率及比活力,重复3次实验。

1.2.5.4 浸提温度对α-AI抑制活力的影响 准确称取5 g样品,固定浸提液体积为200 mL、pH为4.0、浸提时间3.0 h,研究浸提温度为20、30、40、50、60、70 ℃时α-AI的抑制率及比活力,重复3次实验。

1.2.6 响应面实验设计 在单因素实验的基础上,采用Design-Expert软件应用响应面分析法[17],选用Box-Behnken通过实验数据拟合响应面模型,以浸提液体积(A),浸提pH(B),浸提时间(C),浸提温度(D)为主要影响因素,以α-淀粉酶抑制率(Y)为响应值,选用Factors=4,Runs=29的中心组合设计,确定实验运行顺序,进行实验并收集数据,分析实验数据,优化因素的设置水平,最终确定最佳提取条件。实验因素水平见表2。

表2 响应面实验的因素水平表

1.3 数据处理

实验中每个处理重复三次,采用Design-Expert软件对数据进行分析,根据Box-Behnken中心组合设计实验,并对结果进行数据分析,应用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 DNS比色法测定条件的确定

通过对DNS比色测定条件多次设计实验研究,得出最佳DNS比色法测定条件为:检测波长535 nm,添加1.0 mL显色剂,沸水浴反应5 min后检测效果最佳。

2.2 葡萄糖标准曲线的制作

以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

由图1可知,标准曲线回归方程为y=0.4332x-0.0005,相关系数为R2=0.9998,表明葡萄糖的质量浓度与吸光度值在一定范围内0.6～3.0 mg/mL有良好的线性关系。

2.3 淀粉浓度标准曲线的制作

以淀粉浓度为横坐标,吸光度为纵坐标做标准曲线,如图2所示。

图2 淀粉浓度标准曲线Fig.2 The standard curve of starch concentration

由图2可知,淀粉浓度标准曲线回归方程为y=0.9136x-0.0096,相关系数为R2=0.9996,表明淀粉的质量浓度与吸光度值在一定范围内0.1～1.0 mg/mL有良好的线性关系。且得出截距a=0.9136,比活力计算公式即为:

2.4 单因素实验结果与分析

2.4.1 不同浸提液体积对α-AI抑制活力的影响 从图3可以看出,随着浸提液体积不断的增大,α-AI抑制率和比活力不断增加,因为在低的固液比环境下,料液体系分散不均匀,不利于样品的充分溶解,所以此时α-AI提取率较低,进而导致反应检测的抑制率较低;当浸提液体积增加到200mL以后,抑制活力不再有明显的变化,此时表明α-AI有效成分基本浸出。在实际生产过程中,对于浸提法,溶剂的用量至关重要。用量过少会导致浪费,且提取率低;用量过大不利于后期的浓缩纯化,综上所述,选取200mL浸提液体积为最佳。

图3 浸提液体积对α-AI抑制活力的影响Fig.3 Effect of soaking liquid volume on the inhibition activity of α-AI

2.4.2 不同pH对α-AI抑制活力的影响 从图4可以看出,当pH小于3.0时,随着pH的增加,α-AI抑制率及比活力明显上升;当pH在3～4时,随pH增加α-AI抑制率及比活力略有上升，但当pH大于4.0时,α-AI抑制率及比活力有所下降。选用酸性溶液更容易使蛋白充分溶出,并且在酸性溶液浸提时样品澄清而透明,能除掉较多的杂蛋白。而在碱性条件下浸提时,溶液呈现黄色不透明状,同时当碱性过强时,容易发生α-AI抑制剂发生脱氨、脱羧等情况,引起胱赖反应而产生有毒物质,同时还会产生异味,造成α-AI抑制剂的损失,故选取pH=4.0为最适浸提pH。

图4 pH对α-AI抑制活力的影响Fig.4 Effect of pH on the inhibition activity of α-AI

2.4.3 不同浸提时间对α-AI抑制活力的影响 由图5可以看出,浸提时间从0.5 h到2.0 h,抑制率及比活力明显上升,从2.0 h到5.0 h上升效果不明显,说明在2.0 h时,活性成分在细胞内外的浓度已达到平衡,从生产周期以及实验室设备考虑,应该降低提取成本,减少时间,故选取2 h为最佳浸提时间。

图5 浸提时间对α-AI抑制活力的影响Fig.5 Effect of extraction time on the inhibition activity of α-AI

2.4.4 不同浸提温度对α-AI抑制活力的影响 由图6可以得出,当温度在20～40 ℃之间时,浸提效果明显增高,40 ℃时抑制效果最好;而从40～70 ℃,抑制率及比活力有所下降,但下降幅度不大且仍然具有较高活性,这说明此抑制剂在高温条件没有发生变性,具有较好的热耐受性[2],从图6中可看出,适度的增加提取液的温度可以提高浸提效果,故本实验选取40 ℃为最佳浸提温度。

图6 浸提温度对α-AI抑制活力的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on the inhibition activity of α-AI

2.5 响应面分析实验结果与分析

2.5.1 响应面分析实验设计方案 以浸提液体积(A)、pH(B)、浸提时间(C)、浸提温度(D)为主要影响因素,抑制率(Y)为响应值,进行响应面分析。响应面实验设计因素水平表2,中心组合设计实验及结果见表3,回归方程方差分析结果如表4。

表3 中心组合设计实验及结果

2.5.2 回归方程的建立与检验 运用Design-Expert数据统计分析软件对表3实验结果进行多元回归拟合,拟合所得奶花芸豆α-淀粉酶抑制率(Y)的多元二次回归方程如下:

Y=+94.54-0.69A+3.07B+3.60C+0.40D+2.37AB+0.75AC+1.75AD-2.97BC-0.79BD-0.43CD-6.81A2-5.34B2-4.57C2-2.10D2对该回归模型及其系数进行显著性检验,结果见表4。

表4 回归方程方差分析结果

注:“*”表示影响显著(p<0.05),“**”表示影响极显著(p<0.01)。

2.5.3 响应面分析法分析各因素间的相互作用结果 奶花芸豆α-淀粉酶抑制剂提取回归优化响应曲面如图7所示。由图7可知,浸提液体积、pH、浸提温度和浸提时间四个因素之间两两相互作用对奶花芸豆α-淀粉酶抑制剂的含量均呈现出显著的二次效应。结合方差分析表4中浸提液体积、浸提温度和浸提时间三个因素二次项的p值均小于0.01,表明各个因素之间的交互作用极显著。从图7c中可以看出浸提液体积与浸提温度对α-AI抑制率的影响较明显,三维空间所绘的曲面较陡,说明浸提液体积与浸提温度的交互影响尤为显著,浸提时间与浸提温度的交互影响仅次于浸提液体积与浸提温度,如图7f所示。由图7e及方差分析表4可知pH与浸提温度之间的交互影响显著。由图7a、图7b和图7d可知,浸提液体积与pH、浸提液体积与浸提时间及及pH与浸提时间之间的交互影响作用较小。

图7 奶花芸豆α-淀粉酶抑制剂提取响应曲面图Fig.7 The response surface on extraction alpha-amylase inhibitor of phaseolus vulgaris

2.5.4 最优条件的确定及验证 利用Design-Expert软件对模型进行进一步分析,获得最优的提取条件:浸提液体积196.44 mL,pH3.5,浸提时间2.31 h,浸提温度42.97 ℃。在此条件下奶花芸豆中α-AI抑制率的理论预测值为87.82%。

在最佳的提取条件下在实验室进行验证实验控制浸提液体积为200 mL,pH为3.5,浸提时间2.3 h。浸提温度43 ℃,样品质量为5 g。在此条件下进行三次重复实验,奶花芸豆中α-AI的抑制率达到85.30%,比活力为5.13 U/mg,与理论抑制率相差2.87%。由此可见,响应面分析的的优化结果与实际值较吻合,得到的提取工艺条件具有一定的应用价值。

3 结论

实验结果得到新疆奶花芸豆中α-AI的最优提取条件为:准确称取5 g样品,添加浸提液体积200 mL,pH3.5,浸提时间2.3 h,浸提温度43 ℃。在此条件下奶花芸豆中α-AI的抑制率为85.30%,比活力为5.13 U/mg。从本文的测定结果可知,来源于奶花芸豆的α-AI对α-淀粉酶有很好的抑制作用,对奶花芸豆的研究、开发提供有益的数据。

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Optimization of extraction of alpha-amylase inhibitor fromPhaseolusvulgarisby response surface methodology

YU Xue-hui,TIAN Tong-tong,ZHANG Jian*

(Food College of Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions of alpha-amylase inhibitor fromPhaseolusvulgaris. Based on the results of the single factor experiments,the effects of four independent variables(volume of extraction solvent,extraction pH value,extraction time and extraction temperature)on theα-AI inhibition rate were investigated by Box-Behnken experimental design of four factors and three levels. A quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up. And the optimal extraction parameters to obtain the highest inhibition rate were as follows:the solvent volume was 200 mL,pH3.5,43 ℃ and 2.3 h for extraction per time. The inhibition rate under the optimum conditions was found to be 85.30%,which agreed with the predicted value of 87.82%. Results showed that the optimized method was stable and reliable. It could lay the foundation for the research,development of thePhaseolusvulgaris.

Phaseolusvulgaris;α-amylase inhibitor;response surface method

2016-08-29

于雪慧(1993-)，女，硕士研究生，主要从事食品生物化学方面的研究，E-mail：417950977@qq.com。

*通讯作者:张建(1979-)，男，博士，副教授，主要从事食品生物化学方面的研究，E-mail:zhangjian0411@163.com。

TS239

A

1002-0306(2017)06-0223-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.034