芪参颗粒对后负荷加重小鼠心肌组织中Fas/Fasl凋亡信号转导通路的影响

任卫全，于 雪，范潇婷，王 伟，郭淑贞

芪参颗粒对后负荷加重小鼠心肌组织中Fas/Fasl凋亡信号转导通路的影响

任卫全，于 雪，范潇婷，王 伟，郭淑贞

目的 从细胞凋亡角度探讨芪参颗粒(QSG)对后负荷加重小鼠心肌保护的作用机制。方法 40只SPF级雄性C57小鼠按体质量分为手术组(30只)和假手术组(10只)，手术组利用主动脉弓缩窄术制备小鼠心肌肥厚模型，将成模后存活小鼠随机分为3组：模型组，芪参颗粒组和福辛普利组，每组10只。治疗4周后取小鼠心脏组织进行Western blot检测Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的表达，实时荧光定量PCR法检测Fas和caspase8水平。结果 Western blot结果显示：与假手术组相比，模型组的Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的表达均显著升高(P <0.05)；与模型组相比，芪参颗粒组、福辛普利组可明显下调心肌肥厚小鼠心肌组织中Fas、caspase8和 cleaved-caspase3(P <0.05)的蛋白表达，芪参颗粒组较福辛普利组更有优势；实时荧光定量PCR结果显示，芪参颗粒组、福辛普利组均有下调心肌肥厚小鼠心肌组织中Fas、caspase8表达的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。结论 在转录后水平调节Fas/Fasl凋亡信号转导通路相关蛋白、抑制凋亡可能是芪参颗粒发挥对后负荷加重小鼠心肌保护作用的重要机制之一。

心肌肥厚；芪参颗粒；细胞凋亡；Fas/Fasl；小鼠

心肌肥厚是高血压、心瓣膜病等多种心血管疾病的共同并发症，是由多条信号转导通路和众多的信号分子导致心肌结构、功能的改变，其中就包括心肌细胞凋亡的过程[1-3]。目前认为 Fas/Fasl 系统介导的细胞凋亡信号通路是细胞凋亡的重要途径之一[4- 5]。而caspase 家族蛋白酶的激活在细胞凋亡的执行过程中起着关键作用，其中 caspase3是caspase 家族成员中最重要的蛋白之一，caspase3切割(cleaved)活化之后就会变成cleaved-caspase3，即后者是前者的活化形式。caspase3 蛋白酶参与多种途径诱导的细胞凋亡，与细胞凋亡的关系十分紧密。同时，caspase8 作为 caspase 的启动者，而 caspase3 被划分为caspase 的执行者[6]。芪参颗粒(QSG)组成成分包括黄芪、丹参、甘草等药味，可以有效地防治心肌肥厚及心衰[7- 8]。本研究从细胞凋亡的角度，探讨芪参颗粒对后负荷加重小鼠(TAC)心肌保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 正常6周龄SPF 级雄性C57小鼠40只，体质量(16±1)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。40只雄性C57BL/6小鼠饲养于北京中医药大学SPF级动物实验室。小鼠适应性喂养1周后，按照体质量随机分为两组：手术组30只，假手术组10只。手术组行TAC(Transverse Aortic Constriction) 造模术。将其中30只造模成功的小鼠按照体质量分为3组：模型组，福辛普利组和芪参颗粒组。10只假手术组动物除穿线不结扎外，其余同手术组。

1.2 药物与试剂 QSG由黄芪、丹参、甘草等药味组成，药材均购于北京同仁堂制药有限公司。处方诸药合并，采用水提醇沉工艺制备，由北京中医药大学中药学院提供。福辛普利中美上海施贵宝制药有限公司提供(批准文号：国药准字H19980197)；Trizol Reagent (ambion，15596026，made in USA)； Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific，K1622)；SYBR Select Master MIX (applied Biosystems，4472908，made in USA)；RIPA裂解缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司，货号：C1053)；Bradford法蛋白质定量试剂盒(货号：P1510)；Anti-Fas antibody(Proteintech，货号：60196-1-lg)；Anti-Caspase8 antibody(Proteintech，货号：13423-1-AP)；Anti-Caspase3 antibody(Proteintech，货号：19677-1-AP)。

1.3 仪器 小动物呼吸机( SAR-1000ventilator 美国) 、鹅颈冷光源、小鼠外科显微手术器械、Vevo2100 超声仪( Visual Sonics 加拿大)；凝胶成像仪及图像分析系统(美国BIO-RAD，Molecular Imager ChemiDocTM XRST with ImageLabTM software)；电泳及电转系统(Miniin，美国Bio-Rad，MiniPROTEANR Tetra Cell 552BR 057972；Mini Trans-BlotR Cell153BR 74593)； ABI StrpOnePlus Real-Time PCR System(美国ABI公司)。

1.4 复制压力负荷型心衰小鼠模型的方法 称重与麻醉： 小鼠(16±1)g称重，经戊巴比妥钠(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉。固定、气管插管和机械通气，麻醉后开胸；胸廓酒精消毒，自制插管(22G静脉套管针外鞘)进行气管插管，随后将5-0真丝编织线用钩状弯镊提出，使得丝线包绕过主动脉弓进行结扎，打结后，关胸。假手术组动物仅行开胸操作，而不进行主动脉弓缩窄操作，其余操作步骤与模型组相同[9]。

1.5 给药 术后第2天开始给药，QSG组每日给予生药QSG 14.66 g/kg，相当于临床等效剂量；福辛普利组每日予福辛普利1.83 mg/kg，均以水溶，每天灌胃给药，灌胃体积为1.0 mL/100 g；假手术组和模型组每日给予相同体积纯水灌胃，持续4周。给药4周，摘取心脏，称重后留取左心室组织，放入液氮内保存。

1.6 荧光定量PCR法检测Fas、caspase8的表达 荧光定量PCR引物、探针序列(见表1)；Trizol法在冰上提取细胞总RNA；逆转录cDNA；将cDNA产物放在-20℃保存；实时定量荧光PCR； 2-△△CT法分析基因相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.7 Western blot检测Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的蛋白表达 蛋白质提取：应用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，应用Bradford法蛋白质定量；配制聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，12%)；SDS-PAGE电泳：选取恒压(80V)进行电泳；SDS-PAGE转膜印迹：恒压(75V)进行电转70 min；用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；免疫反应：Fas、caspase8和cleaved-caspase3(稀释比例均为1∶1 000)一抗杂交袋中4℃过夜。二抗(稀释比例为1∶5 000)室温摇床60 min；显影：ECL发光液曝光显影，BIO-RAD XRS凝胶成像仪分析，记录每条蛋白泳带的灰度值，进行定量分析。

2 结 果

2.1 Western blot检测Fas、caspase8和cleaved-caspase3的蛋白表达 在蛋白质相对分子量为65KD和42 KD处有条带，分别是Fas和β-actin蛋白表达；蛋白质caspase8的相对分子量为42KD；蛋白质cleaved-caspase3的相对分子量是18 KD；模型组较假手术组Fas、caspase8和 cleaved-caspase3蛋白表达明显升高(P <0.05)，治疗后芪参颗粒组和福辛普利组的Fas、caspase8和cleaved-caspase3蛋白表达均有下降，且与模型组相比差异有统计学意义(P <0.05)。详见图1。

注：A为各组蛋白印迹(1、2、3、4分别为假手术组、模型组、芪参颗粒组、福辛普利组)；B为Fas蛋白各组表达量；C为caspase8蛋白各组表达量；D为cleaved-caspase3蛋白各组表达量。与假手术组比较，#P <0.05，##P <0.01；与模型组比较，△P <0.05，△△P <0.05。 图1 Western blot检测各组小鼠心肌组织中Fas、caspase8和 cleaved-caspase3蛋白表达

2.2 实时定量荧光PCR检测Fas、caspase8的表达 模型组较假手术组Fas、caspase8 基因表达升高；与模型组相比，芪参颗粒组能降低心肌中Fas、caspase8基因的表达，无统计学意义，但有一定的趋势。详见图2。

注：A为Fas基因各组表达量；B为caspase8基因各组表达量。图2 实时定量荧光PCR检测各组小鼠心肌组织中Fas、caspase8基因表达

3 讨 论

心肌肥厚是多种心血管疾病的并发症，其是心衰发生的独立危险因素，能够对心肌肥厚逆转治疗，减少心衰的发生和死亡率[9]。研究已经证实，主动脉弓缩窄术小鼠模型是还原压力超负荷导致心肌代偿性肥大到失代偿性心衰病理生理发展过程的理想模型[10]。

细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，1972年由Kerr，Wyllie和Currie首次提出并指出其不同于普通的细胞死亡[11]。关于心肌细胞凋亡的分子机制研究很多，心衰过程中细胞凋亡诱导因素也很多，目前研究比较完善的通路为AngⅡ介导的凋亡通路，其他因素介导的复杂繁多信号凋亡通路还不清楚[12]。本实验所研究的是TNF 受体家族转导途径，其中最为关键的一部分就是Fas介导的细胞凋亡信号转导通路，并起到决定性作用的一部分。Fas存在于靶细胞上，FasL通过三聚体的形式与之相结合。诱导、Fas 三聚化，从而激活 Fas 相关的死亡结构域(FADD)，FADD 能够通过C端的DD结合Fas；另外它能通过其N端具有致凋亡能力的死亡效应结构域(DED)招募procaspase 8到Fas 区域。caspase8自我剪切活化，从而启动了caspase家族酶链反应，cleaved-caspase3是 caspase家族酶链反应的最终执行者，最终影响了细胞的结构蛋白，从而导致细胞凋亡的发生[13]。心脏超负荷早期心肌细胞代偿性肥大，随着病程的恶化，细胞凋亡导致心肌细胞数量减少。因此，各种方式诱导的细胞凋亡使心肌细胞大量丢失，当细胞数量减少到一定程度，心室重构，收缩力下降可能导致心衰[14- 15]。凋亡同时又加速心衰进展，抑制心肌细胞凋亡可以减轻心脏重构，改善心功能。

通过本研究可以明确的结论有：后负荷加重小鼠心肌细胞内Fas、caspase8和 cleaved-caspase3的表达较假手术组升高，即心肌肥厚乃至心衰的确会促进细胞凋亡的发生，这一点与国内外的研究结论一致。芪参颗粒用药4周后对Fas、caspase8和cleaved-caspase3表达的确有影响，并优于福辛普利，即对细胞凋亡的调控确实是芪参颗粒心肌保护作用的机制之一。

仍需进一步研究的问题：western blot结果显示在蛋白水平，芪参颗粒确实起到了调节Fas/Fasl信号通路蛋白的作用，并且作用显著，但在转录水平，实时定量荧光PCR结果显示芪参颗粒对Fas、caspase8基因表达的调控没有统计学意义，表明芪参颗粒对于Fas、caspase8的影响主要在转录后环节。在后期实验中本课题组会根据不同的模型进行多方位的验证，在已有实验结论的基础上进一步探索芪参颗粒通过调节细胞凋亡通路改善心肌功能的作用。

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(本文编辑王雅洁)

Qishen Granule Regulated the Fas/Fasl Apoptotic Pathway in Myocardial Tissues of Mice with Transverse Aortic Constriction

Ren Weiquan， Yu Xue， Fan Xiaoting， Wang Wei， Guo Shuzhen

School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Guo Shuzhen

Objective To explore the mechanism of Qishen granule (QSG) on the myocardial protection in mice with transverse aortic constriction (TAC).Methods Forty SPF grade male C57 mice were divided into operation group (n=30) and sham operation group (n=10) according to the body mass.Mice in the operation group were prepared by transverse aortic constriction to induce cardiac hypertrophy， and then were randomly divided into model group(n=10)， QSG group (n=10) and fosinopril group (n=10).After 4 weeks of treatment according to group， the left ventricular was collected.Subsequently， the protein of Fas， caspase 8 and cleaved-caspase 3 were analyzed by western-blot while the mRNA expression of Fas and caspase 8 were tested by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Protein expression of Fas caspase 8 and cleaved-caspase 3 increased dramatically in model group comparing to sham group (P<0.05).Compared with model group， the protein expression of Fas， caspase 8 and cleaved-caspase 3 decreased in QSG group and fosinopril group (P<0.05)，which was lower in QSG group than that in fosinopril group.The result of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the the mRNA expression of Fas and caspase 8 in the myocardium of myocardium was decreased， but there was no significant difference (P>0.05).Conclusion QSG regulated moleculars in Fas/Fasl apoptotic pathway at their post-transcription stage and then decreased apoptosis in myocardial tissue with hypertrophy.

cardiac hypertrophy；Qishen granule；apoptosis；Fas/Fasl

北京市科技新星(No.xx2014A009)；杰出青年人才项目(No.2015-JYB-XYQ002)；教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NCEF13-0692)

北京中医药大学基础医学院(北京 100029)

郭淑贞，E-mail：guoshz@bucm.edu.cn

R285.5 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.009

1672-1349(2017)06-0667-04

2017-01-18)

引用信息：任卫全，于雪，范潇婷，等.芪参颗粒对后负荷加重小鼠心肌组织中Fas/Fasl凋亡信号转导通路的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(6)：667-670.