2013年—2015年辽宁地区猪圆环病毒2型遗传演化分析

关 淼，曹 东，赵晓彤，杨本勇，陈 瑶，赵凤菊，崔基贤，申贯男，顾贵波

(辽宁省动物疫病预防控制中心/辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164)



2013年—2015年辽宁地区猪圆环病毒2型遗传演化分析

关 淼，曹 东，赵晓彤，杨本勇，陈 瑶，赵凤菊，崔基贤，申贯男，顾贵波*

(辽宁省动物疫病预防控制中心/辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164)

为了解2013年—2015年辽宁地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况，采用PCR对辽宁地区采集到PCV2阳性病料样品进行全基因组扩增，并应用DNA Star软件进行序列比对和遗传演化分析。结果表明，检测的15株PCV2全基因组全长为1 767 bp和1 768 bp，基因核酸序列同源性为94.4%～99.8%；15株PCV2毒株中有11株属于PCV2b基因型，4株属于PCV2a基因型。结果表明，目前在辽宁地区有多种血清型PCV2同时流行，应该针对优势血清型制定免疫策略。

猪圆环病毒2型；序列分析；遗传变异

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus type 2-associated disease，PCVAD)的主要病原体，PCVAD是多种综合征和疾病的统称，其临床形式包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸系统综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、增生性坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP)、繁殖障碍等[1-3]。更重要的是，PCV2可以导致感染猪的免疫力下降，使之对其他病原体的易感性增高。PCV2在世界范围内流行广泛，普遍存在于猪群当中，很多猪场表现出极高的阳性率，每年都给包括中国在内的世界养猪业造成巨大的经济损失。自从1998年PCV2被第一次报道以来，已经引起了农业相关部门、农场主以及兽医工作人员的极大关注[4]。

本研究在辽宁省范围内通过使用分子克隆技术对PCV2流行毒株进行了全基因组序列测定，并与GenBank公布的国内外PCV2参考毒株进行同源性比较和遗传演化分析，确定近年来辽宁地区PCV2流行毒株的基因型，了解不同亚型的PCV2毒株在辽宁地区的分布及基因进化情况，建立辽宁地区PCV2毒株遗传信息数据库，有助于了解和掌握辽宁地区PCV2的遗传变异规律，为该病毒的分子流行病学研究奠定基础，同时为PCV2疫苗的研究和发展提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒阳性病料样品 使用荧光PCR，检测2013年—2015年辽宁地区季度例行监测采集的组织样本，挑选不同时间、不同地区的PCV2核酸阳性的样品，于-70℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA Marker、pMD18-T载体，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCV2全基因组扩增及序列测定 根据GenBank公布的国内外PCV2参考毒株的PCV2基因序列以及外文文献，合成一对特异性引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。挑选检测结果阳性较强的PCV2核酸阳性组织样品，按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA作为PCR模板。参考PCR试剂盒说明书进行扩增，产物进行10 g/L琼脂凝胶电泳鉴定。将PCR产物纯化连接于pMD-18T载体，阳性质粒样品送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。

1.2.2 PCV2全基因序列分析 应用DNA Star软件，将测定的PCV2辽宁分离毒株基因核苷酸序列与从GenBank中选取的15株国内外PCV2参考序列(国外4株，国内11株)(表2)进行同源性比较并绘制遗传进化树。

表1 引物序列及其扩增片段

表2 PCV2参考序列

2 结果

2.1 PCR结果

PCR结果显示，可以从组织样品中扩增到位于2 000 bp附近的特异性条带，与预期大小相符(图1)。通过病毒分离鉴定及PCR，最终在2013年—2015年辽宁地区病料中成功得到15株PCV2毒株，其中2013年5株，2014年5株，2015年5株。

M.DNA 标准DL 2 000;1、2.组织病料样品

2.2 PCV2全基因测序结果及分析

基因测序结果表明，本研究分离到的毒株的核苷酸长度为1 767 bp或1 768 bp。使用MegAlign软件进行核酸序列比较分析，结果见图2。由图2可见，本研究分离测定的15株PCV2毒株之间的基因核酸序列同源性为94.4%～99.8%，不同年度毒株之间的基因核酸序列同源性为94.4%～99.8%，不同地区毒株间同源性均为95%～99.5%。其中，2013年不同地区5株PCV2毒株间基因核酸序列同源性为94.9%～99.7%，2014年不同地区5株PCV2毒株间基因核酸序列同源性为94.9%～99.8%，2015年不同地区5株PCV2毒株间基因核酸序列同源性为94.4%～99.8%。2013年—2015年间，辽东地区3株PCV2毒株间基因核酸序列同源性为95.3%～99.5%，辽南地区3株间基因核酸序列同源性为95.5%～97.8%，辽西地区3株间基因核酸序列同源性为99.3%～99.7%，辽北地区3株间基因核酸序列同源性为96%～99.4%，辽中地区3株间基因核酸序列同源性为95%～95.4%。

与国内外15株PCV2代表毒株基因核酸序列进行同源性比较分析发现，15株PCV2辽宁分离毒株与4株国外代表毒株基因核酸序列同源性为95%～99.9%，与11株国内其他地区代表毒株间同源性为94.1%～99.7%。其中，与欧洲PCV2代表毒株同源性为95.6%～98.6%，与北美洲PCV2代表毒株同源性为95%～99.9%，与南美洲PCV2代表毒株同源性为95.1%～99.8%。在外国代表毒株中，与美国分离株同源性相对较高为95%～99.9%，与英国分离株同源性相对较低为95.6%～98.6%。与国内PCV2代表株相比，和处于同一地理区域的东北地区PCV2毒株基因核酸序列同源性为94.9%～99.6%；与华北、华东、华南、华中、西北和西南PCV2同源性分别为94.1%～99.7%、94.4%～99.6%、95.3%～99.4%、94.7%～99.7%、94.7%～96.6%和95.6%～99.7%(图2)。

按照Olvera提出的PCV2分型标准，根据系统进化树的遗传演化分析发现，15株PCV2辽宁地区毒株中有11株属于PCV2b基因型，4株属于PCV2a基因型；PCV2b基因型中，1A/1B亚群5株， 1C亚群6株。2013年5株PCV2毒株中，2株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，2株属于PCV2b基因型1c亚群，1株属于PCV2a基因型；2014年5株PCV2毒株中，1株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，2株属于PCV2b基因型1c亚群，2株属于PCV2a基因型；2015年5株PCV2毒株中，2株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，2株属于PCV2b基因型1c亚群，1株属于PCV2a基因型。2013年至2014年，辽东地区3株PCV2毒株中，1株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，2株属于PCV2a基因型；辽南地区3株PCV2毒株中， 2株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，1株属于PCV2a基因型；辽西地区3株PCV2毒株均属于PCV2b基因型1C亚群；辽北地区3株PCV2毒株中，1株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，2株属于PCV2b基因型1C亚群；辽中地区3株PCV2毒株中，1株属于PCV2b基因型1A/1B亚群，1株属于PCV2b基因型1C亚群，1株属于PCV2a基因型(图3)。

图3 基于PCV2全基因序列的系统进化树

3 讨论

自从PCV2被确定以来，陆续有研究报道该病毒已经在美国、欧洲和亚洲一些国家和地区广泛存在和蔓延，目前在世界各国的PMWS、PNDS等病猪体内分离到该病毒。我国自郎洪武等[5]于2000年首次应用ELISA检测到PCV2的流行以后，在各省、市及地区也陆续有该病发生和流行的报道。王忠田等[6]对我国多个省市的12个疑似发生PMWS的养猪场进行的调查研究发现，其中11个猪场发生疾病由PCV2感染引起的PMWS，1个由PCV2感染导致的PDNS。曹胜波等[7]研究发现，我国PCV2分离株与国外分离株的同源性不是很高，推测我国已较长时间存在PCV2，经过多年的感染和流行已发生了不同程度的变异。张青占等[8]通过研究表明，在PMWS发病猪样品中，PCV2阳性率高达75%。

根据PCV2基因的遗传进化特征，Olvera将PCV2分为2个基因型PCV2a和PCV2b，PCV2a和PCV2b又可以进一步分为2A～2E和1A～1C 8个基因亚型，其中1A和1B基因亚型具有共同的进化起源，被划分为1A/1B基因亚型。基于PCV2衣壳蛋白基因分析，除了PCV2a和PCV2b 2个亚群，PCV2还被分成PCV2c、PCV2d 4种主要基因型[9]。Xiao C T等[10]研究表明，PCV2d虽然最初于1999年在瑞士被分离到的，但是现已在中国广泛传播，并且从2012年开始在北美就有出现。Li L等[11]研究发现，在2004年—2014年间，河北存在PCV2b和PCV2d 2种基因亚型，并且所有的PCV2d基因亚型都是在2009年—2014年被分离到了，表明PCV2可能发生高度的遗传变异和明显的基因亚型的更替。研究表明，在亚洲PCV2毒株的基因亚型主要为PCV2a、PCV2b和PCV2d，Liu X等[12]通过对分离到12株PCV2毒株进行遗传演化分析发现，有3株分离株与PCV2c基因亚型在ORF1区域具有高度的同源性，而这种亚型之前只在丹麦被分离到，表明这些分离株可能是从丹麦传输进中国的。

本研究从辽宁地区2013年—2015年的例行监测样品中分离到15株PCV2流行毒株，序列比对结果显示，辽宁地区15株PCV2流行毒株中11株1 767 bp，4株为1 768 bp，通过序列比对可见存在不同的突变位点，说明辽宁地区PCV2毒株具有多样性。15株PCV2毒株之间的基因同源性为94.4%～99.8%；与国内外15株PCV2代表毒株基因进行同源性比较分析发现，与4株国外代表毒株基因核酸序列同源性为95%～99.9%，与11株国内其他地区代表毒株间同源性为94.1%～99.7%。其中2015年在辽宁中部与辽宁西部的分离株同源性最低为94.4%，2014年辽宁东部与同年在南部分离到的毒株同源性最高为99.8%。2013年辽宁东部分离株与JX535297美国分离株基因同源性高达99.9%，表明它们可能具有相同的遗传演化来源，可能是由国外传入。

遗传演化分析结果表明，分离到的15株PCV2辽宁分离株有4株属于PCV2a基因型，11株位于PCV2b基因型中，其中PCV2b 1A/1B亚群5株，PCV2b 1C亚群6株。表明辽宁地区PCV2的基因型有PCV2a和PCV2b的共存，但是有PCV2a到PCV2b的转换，并且目前以PCV2b基因型为优势毒株。有研究报道我国从2008年以来PCV2b 1A/1B为主要流行致病毒株，近些年的研究也有PCV2b 1C毒株的报道，并且呈逐渐增多的趋势[13]。这与本次研究的结果相符，本研究分离到的PCV2b基因型中1A/1B与1C基因亚型分离株数量相当，表明在辽宁地区有多种PCV2基因型同时存在和流行。系统进化树分析还发现，不同地区的毒株可以处于同一分支，同时同一地区毒株也会属于不同亚型；有同一地域不同年度毒株处于同一分支，也有同一年度不同地区的毒株处于同一亚型。上述分析结果表明，不同基因型及不同亚型的PCV2毒株没有明显的地域分布特征，2013年—2015年辽宁地区15株PCV2毒株之间也没有明显的时序性特征。

Beach N M等[14]在报道中指出，虽然现在基于PCV2a的商业疫苗对PCV2b可以提供交叉保护，但是基于PCV2b的减毒活疫苗也正在开发中，其可以提供更强有力的保护并可以降低疫苗成本。Opriessnig T等[15]通过分别给16头猪接种基于PCV2a基因型PCV1-2a试验性嵌合减毒活疫苗和基于PCV2b基因型PCV1-2b试验性嵌合减毒活疫苗来比较基于PCV2a和PCV2b疫苗控制PCV2b病毒血症的能力，结果显示，与接种PCV1-2a相比，接种PCV1-2b嵌合疫苗的猪表现显著的较高水平的PCV1-2b病毒血症，同时在粪便和鼻分泌物中可以检出PCV1-2b疫苗毒，并且通过更高的ELISA S/P比表明其可以产生更为强大的体液免疫应答。针对PCV2的遗传演化分析，旨在了解辽宁地区PCV2的优势毒株及其基因型，通过分析它们之间的遗传演化关系和变异规律，为PCV2免疫策略的制定提供参考依据，为有效预防该病疫苗的研究和开发提供科学依据。

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Genetic Variation Analysis of PCV2 Isolates in Liaoning Area from 2013 to 2015

GUAN Miao，CAO Dong，ZHAO Xiao-tong，YANG Ben-yong，CHEN Yao，ZHAO Feng-ju，CUI Ji-xian，SHEN Guan-nan，GU Gui-bo

(LiaoningCenterForProvincialAnimalEpidemicDiseaseControlandPrevention,VeterinaryMedicineInstituteofLiaoningProvince,Shenyang,Liaoning,110164,China)

In order to understand the genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) in Liaoning from 2013 to 2015,the full sequence of PCV2 gene was amplified by PCR from the PCV2 positive samples in Liaoning province,and the sequence alignment and genetic variation analysis were conducted by DNA Star.The results showed that the full genome length of 15 PCV2 strains were 1 767 bp and 1 768 bp,the gene nucleic acid sequence homology was 94.4% to 99.8%;11 strains of 15 PCV2 strains belonged to PCV2b genotype,4 strains belonged to genotype PCV2a.The results showed that a variety of serotype PCV2 were epidemic at present,the immune strategies according to the dominant serotypes should be developed.

PCV2; sequence analysis; genetic variation

2016-09-08

辽宁省科学技术计划面上项目(2014020159)

关 淼(1982-)，男，辽宁鞍山人，兽医师，硕士，主要从事动物疫病诊断研究与防控工作。

S852.659.2

A

1007-5038(2017)04-0013-06

*通讯作者