微孢子虫研究进展

吴 杰 ， 项 勋，赵屹钦，邓紫艳，王世玉，常 华

(云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201)



微孢子虫研究进展

吴 杰 ， 项 勋，赵屹钦，邓紫艳，王世玉，常 华*

(云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201)

微孢子虫是人类、哺乳类、昆虫等脊椎动物以及无脊椎动物专性细胞的寄生真核生物，是常见的人兽共患寄生原虫。目前已有14种微孢子虫被报道能够感染人类并致病，在兽医公共卫生方面也是比较重要的问题之一。论文从微孢子虫的病原学、蛋白质研究、检测技术及防治等方面进行综述。

微孢子虫；病原学；检测；分子生物学

微孢子虫(Microsporidia)广泛分布于脊椎、无脊椎动物中，包括两栖类、哺乳类、昆虫以及人类，是一种原虫病，多见于鱼类[1]、蚕业中。在19世纪50年代中期，整个欧洲的蚕丝产业都受到严重威胁，迫使人们不得不对病因进行研究，在此过程中发现家蚕微孢子虫。该家蚕微孢子虫是第一种被记录的微孢子虫[2]。

微孢子虫缺少真核生物中常见的细胞器，包括高尔基体、线粒体、过氧化物酶体等，而且核糖体结构与原核生物的相似。最初认为微孢子虫是缺乏线粒体的，但是有研究发现，微孢子虫中具有线粒体的分子痕迹[3]。1995年，Clark C和Roger A在溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)中发现能够编码线粒体蛋白的相关基因，并确认该生物为一种古真核生物；随后在蝗虫微孢子虫中发现了与真核生物线粒体很相似的热激蛋白HSP70。在蝗虫微孢子虫与兔脑炎微孢子虫(Enterocytozooncuniculi)基因组中也发现与线粒体相关基因。因此，研究者认为微孢子虫的线粒体结构是在进化中丢失，并非一开始就没有。

近年来，随着感染微孢子虫人群的增多，对微孢子虫的检测方法也越来越多，国内外较为常用的为套式PCR技术[4]，与多位点序列分型技术[5-7]对MS1、MS3、MS4、MS7等4个基因位点进行分析研究。微孢子虫多感染AIDS病人，并致使患者腹泻等，现在还没有有效的药物对其进行治疗。本文从微孢子虫的病原学、蛋白质研究及检测、防治等方面进行阐述，为今后研究提供参考。

1 病原学

1.1 病原种类

目前，在世界上报道的1 400种微孢子中有8属14个种被发现能够使人类感染，其中的毕氏肠微孢子虫(E.bieneusi)、兔脑炎微孢子虫(Enterocytozooncuniculi)、海伦脑炎微孢子虫(E.hellem)、肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis)是感染人类比较普通的，且孢子较小的4种微孢子虫。仅仅由毕氏肠微孢子虫对人类造成的感染，就达到90%以上。

1.2 生活史

一般可将微孢子虫的生活史分为3个时期。在第1时期，也称感染阶段，微孢子虫将其孢子释放到环境中，将具有感染性的孢子内容物，摄入到宿主细胞内；在第2时期，即裂体增殖，微孢子虫即在细胞内繁殖；在第3时期孢子增殖阶段，即可形成感染性的孢子。

1.3 流行病学

1.3.1 国内外研究概况 在1857年微孢子虫首次发现于蚕中，这使得当时欧洲蚕丝产业经济大幅度下滑[8]。1922年首次在兔体内发现感染微孢子虫。1959年，Matsubayashi等在日本报道了第1例人类微孢子虫病的病例。调查发现是一位疑似吃过鲑鱼的9岁男孩体中发现[9]。目前，我国关于人类感染微孢子虫的报道较少，只有刘淑萍等[10]曾报道过微孢子虫，而且发现其会与其他原虫混合感染的病例和感染脑肠炎微孢子虫的病例。

1.3.2 分布 现今的微孢子虫呈世界范围分布，在北美洲、欧洲、澳洲、非洲等地多次报道。起初，微孢子虫被认为多感染于AIDS病人[11]，有报道称这类患者的微孢子虫感染率高达9%～50%, 而且微孢子虫的发病不受季节影响。该寄生虫主要感染AIDS病人，一般感染AIDS病人的多为毕氏微孢子虫与脑肠炎微孢子虫，且寄生于十二指肠下段至空肠上段。感染微孢子虫的病人，一般表现为持续性或慢性腹泻。微孢子虫之所以会使人类致病，是被吞食的成熟孢子在小肠绒毛上皮细胞复制，导致肠绒毛缩短。而且有些绒毛覆盖面积也减少，从而导致病人出现吸收不良伴有腹泻。该寄生虫还会随血液循环到达其他组织，再次对人体造成感染。尤其是使人免疫功能遭到破坏。随着检测技术的改进，在健康人群中也逐渐发现病例。其中器官移植者、儿童与老年人是最易感染微孢子虫人群。患者会产生急性、限行腹泻等症状。微孢子虫可以寄生在人体肺、胆管、肠道、肝脏等组织，也会感染人的眼部，因而可能引起不同病症，如角膜结膜炎、腹泻、肺部感染、肝炎、胆囊炎、皮肤溃烂等。

2 微孢子虫的蛋白

2.1 表面蛋白

最早日本科学家河原畑勇等[12]将家蚕Nosema属通过表面抗原蛋白的结构、组分等差异来给家蚕微孢子虫分类。当时将其区别为Bombycis型、M11型、M12型3种。而在中国陈祖佩等[13]也对不同微孢子虫的表面抗原蛋白差异进行了探究，采用5 g/LK2CO3提取3种家蚕微孢子虫的表面抗原蛋白。实验结果表明3种表面抗原蛋白并无共同成分存在。崔红娟等[14]将去除表面蛋白的微孢子虫，使其感染家蚕，发现表面蛋白被去除掉后，微孢子虫发病缓慢，结果说明其表面蛋白对家蚕致病性或有一定影响。赵唯希等[15]在分离家蚕微孢子虫表面蛋白时，采用0.1mol/L NaOH裂解液与超声波破碎法提取总蛋白，并用SDS-PAGE检测发现，结果可见微孢子虫表面蛋白表达丰富。

2.2 孢壁蛋白

张坤等[16]在研究中发现了Aloc SWP2蝗虫微孢子虫孢壁蛋白，并通过RNAi 干扰、侵染成功对该蛋白的转录过程进行了干扰，感染后的宿主东亚飞蝗蜕皮困难，中肠出现了严重的溃烂，脂肪体含量低微，出现死亡，进行干扰后使蝗虫的死亡过程大幅延长。李艳红[17]则利用免疫沉淀-蛋白印迹-质谱的方法分析与鉴定蚕微孢子虫的孢壁蛋白单克隆抗体的靶蛋白。试验中成功获得抗原蛋白，该抗原蛋白与SWP26孢壁蛋白单克隆抗体是相对应的。谭小辉等[18]通过碳酸钾溶液诱导家蚕微孢子虫发芽，然后将其进密度梯度离心，获取到了SWP32和SWP25孢壁蛋白。试验同时验证这两种孢壁蛋白是由孢壳脱落的可能。

2.3 微管蛋白

家蚕微孢子虫的极管是由极管蛋白PTP1、PTP2 和 PTP3组成[19]。肖圣燕等[20-22]利用cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得了从家蚕分离出的内网虫属微孢子内网虫属微孢子虫Endoreticulatussp. Zhenjiang α-微管蛋白基因cDNA，并通过生物信息软件对其蛋白结构进行了探究。高永珍等通过SDS-PAGE法对家蚕微孢子虫和蓝萤叶甲微孢子的极丝蛋白进行分析。

3 检测

因微孢子虫极小，通常是染色后再进行观察，常用的染色方法有KMnO4-甲基紫法、抗酸的三色染色法、荧光染色剂Calcofluor M2R 染色法等，虽然这些通过染色进行观察的方法比母蛾镜检法的检出率要高。但这些方法一般都不能将微孢子虫鉴定到种。因电子显微镜观察操作步骤繁琐、耗时、费用高等，也不作为常规检测方法。

随着免疫学检测方法的不断发展，已有多种方法被逐渐应用。这些方法有荧光抗体检测法、环状凝聚法、玻片凝聚法、酶联免疫吸附法、单抗间接ELISA等。李艳红等在2006年用间接免疫荧光方法检测体外培养细胞系中的家蚕微孢子虫及极丝弹出过程，研究发现多克隆抗体按1∶100稀释可看到较强荧光的微孢子虫，为黄绿色荧光[23]。姜义仁等[24]采用c-ELISA检测柞蚕微孢子虫，该方法灵敏度可达1.6×105spores/mL。但免疫学检测法在实际操作中缺乏稳定性。

近年来，国内外学者相继采用PCR等分子生物学方法对其进行研究。现在普遍用套氏PCR技术对比氏微孢子虫的ITS[25](转录间隔区)基因序列进行扩增,因为核糖体RNA的ITS在不同分离株之间差异较大，因而可以作为检测比氏肠微孢子虫的标准[26]。同时，与多位点序列分型技术对MS1、MS3、MS4、MS7位点进行微孢子虫的基因型分析研究。刘吉平等[27]设计了VIF/530R引物，该引物可以快速检测家蚕微孢子虫和近缘微孢子虫，结果表明PCR 检测家蚕微孢子虫灵敏度可达到3×104Nb/mL。通过对以rRNA推定假基因为模板设计引物，进行PCR扩增。用PCR对家蚕微孢子虫进行的检测来判断该方法的灵敏度。何永强、吴姗等采用实时荧光定量PCR技术，对家蚕微孢子虫的快速、准确检测奠定了基础。该实时荧光定量PCR避免了PCR检测后电泳带来的污染。

4 治疗

目前尚未有对微孢子虫病的特效药物。有研究发现，烟曲霉素对治疗结膜、角膜炎有明显效果，一般为口服，每天60 mg，但烟曲霉素对患者会产生毒副作用。在治疗初期就已表现出来，如肠胃痉挛、腹泻、体重减轻等。蜜蜂微孢子虫病也可以通过烟曲霉素[28]进行治疗，但会有药物残留在蜂蜜当中，人类使用后会对机体造成一定的伤害。虽然商业合成的烟曲霉素药剂具有较高稳定性，降低了毒性，但其中添加二环己基胺(DCH)同样具有毒性，也会产生药物残留，对人产生危害[29]。有研究表明，其衍生物TNP-470毒副作用较小，是较为有前景的抗微孢子虫药。阿苯达唑能够对微孢子虫的发育、传播等进行有效的抑制，使相应症状得到缓解，但停药后病症会再次发作。也有人试用灭滴灵，剂量为每天服用3次，每次约500 mg；或者服用丙硫咪唑每天2次，每次400 mg，但不会杀死虫体，只对感染微孢子虫而引起腹泻的AIDS患者起缓解作用，一旦停药，也会复发。另外，碘液对控制微孢子虫也有一定的作用。

5 展望

近年来，微孢子虫逐渐被认为不仅可以感染AIDS病人，越来越多感染正常群体，逐渐引起大家关注，关于治疗效果在兽医公共卫生健康问题中也备受关注。目前没有特效药物治疗该病，给人和家畜的健康带来困扰。由上述发现微孢子虫的孢子内部压力变化与孢子发芽有关，孢子的发芽主要受Ca2+、pH等的影响。随着孢子内部压力逐渐增高，孢子发芽加快。由此推测抑制孢子发芽产生可以减少侵染。而很多环境因子会对微孢子虫的发芽造成影响，通过对萌发条件的改变，进而使微孢子虫病的暴发得到良好控制；也可以通过对微孢子虫发育、传播的抑制，从而对其进行治疗与控制。

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Progress on Microsporidia

WU Jie, XIANG Xun, ZHAO Yi-qin, DENG Zi-yan, WANG Shi-yu, CHANG Hua
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan, 650201,China)

The microsporidia are obligate intracellular eukaryotic parasites, especially in vertebrates and invertebrates，such as the humans, mammals, insects, etc. and common zoonotic parasites. At present, there are 14 kinds of microsporidia which have been reported to be able to infect human and make people ill, it is one of the more important problems in veterinary public health. Therefore, this paper made a summary about the etiology of the microsporidia, the studies of protein, the detecting technology, prevention and cure, etc.

microsporidia; etiology; detection; molecular biology

2016-11-15

云南农业大学校青年科研基金项目(A2006096);云南省高校兽医公共卫生重点实验室发展专项(A3008366)

吴 杰(1993-)，女，吉林人，硕士，主要从事人兽共患寄生虫病研究。 *通讯作者

S855.12

A

1007-5038(2017)06-0078-04