三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞PLA2G4A表达及其下游产物的影响❋

苏 靖，李兴广，李卫红，胡艳红，马家宝，张 赛，胡京红，王淑艳，姜昭妍

(北京中医药大学，北京 100029)

三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞PLA2G4A表达及其下游产物的影响❋

苏 靖，李兴广△，李卫红△，胡艳红，马家宝，张 赛，胡京红，王淑艳，姜昭妍

(北京中医药大学，北京 100029)

目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞胞浆型磷脂酶 A2IVA (phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A)表达及其功能的影响。方法:培养大鼠原代脑微血管内皮细胞，氧糖剥夺法制备拟缺血模型，用三七总皂苷及PLA2G4A抑制剂进行干预，通过RT－PCR和Western blotting法检测各组PLA2G4A基因及蛋白表达水平，ELISA法检测各组花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、20－羟二十烷四烯酸(20－hydroxyeicosatetraenoic acid，20－HETE)、血栓素A2 (thromboxanea2，TXA2)/前列环素(prostaglandin I2，PGI2)表达水平。结果:三七总皂苷可显著下调PLA2G4A的基因和蛋白表达，对AA、20－HETE、TXA2/PGI2也有下调作用。结论:三七总皂苷可以下调拟缺血损伤脑微血管内皮细胞PLA2G4A及其下游产物的表达，这可能是三七总皂苷在脑缺血损伤中发挥化瘀通络作用的机制之一。

三七总皂苷;脑微血管内皮细胞;PLA2G4A;AA;20－HETE

传统中药三七具有化瘀通络的功效，临床广泛应用于缺血性中风的治疗。三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要有效组分，研究显示可以有效改善缺血性脑梗死脑血流状态，并减少梗死灶体积［1］。本课题组前期通过基因芯片技术筛选，发现PNS对拟缺血损伤的脑微血管内皮细 胞 (brain microvascular endothelialcells，BMECs)胞浆型磷脂酶 A2IVA(phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A)mRNA具有显著下调效果。因此本研究在前期实验基础上，观察了 PNS对BMECs的PLA2G4A基因和蛋白表达的影响，并以PLA2G4A抑制剂为对照，观察PNS对PLA2G4A下游产物花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、20－羟二十烷四烯酸(20－hydroxyeicosatetraenoic acid，20－HETE)、血栓素A2(thromboxaneA2，TXA2)/前列环素(prostaglandin I2，PGI2)的调节作用，以期揭示PNS在脑缺血中发挥化瘀通络作用的分子机制。

1 方法

1.1 大鼠原代BMECs培养

按本课题组已建立的方法进行原代BMECs培养［2］，用SD大鼠幼鼠(斯贝福公司)进行取材，将幼鼠铡头后取出大脑皮质，研磨并用200目滤膜过滤，刮取滤膜上的滤出物，离心冲洗后得到原代BMECs细胞种于培养瓶中，传至第三代纯度达90%以上时使用。

1.2 氧糖剥夺法(oxygen－glucose－deprived，OGD)制备拟缺血损伤模型

按本课题组已建立的方法制备BMECs拟缺血损伤模型［3］，向第三代BMECs中加入无糖Kerb’s液，后置于气体成分为94%N2、5%CO2、1%O2的三气培养箱中培养6 h。

1.3 PLA2G4A抑制剂浓度筛选

PLA2G4A抑制剂选用Pyrrophenone(Cayman)，其可特异抑制PLA2G4A活性并下调下游产物花生四烯酸的(Arachidonic Acid，AA)生成［4］。实验设置1、2、4、8、16、32、64 μg/ml 7个浓度，每个浓度设8个复孔，同时设置模型组与空白组。将第三代BMEC均匀接种于24孔板，贴壁面积达90%以上使用。OGD造模前2 h给药，造模结束后用ELISA法测各组AA含量，计算出Pyrrophenone对AA的半数抑制量为12.86 μg/ml。

1.4 分组与处理

首先将培养至第三代的BMECs分为正常组、模型组、PNS组3组。正常组不做处理，其余2组按上述方法造模。PNS组造模前2 h给予22 μg/ml PNS(前期实验证实PNS最佳浓度为22 μg/ml［5］)，观察PNS对拟缺血BMECs PLA2G4A mRNA及蛋白表达的影响，以验证基因芯片结果。然后利用PLA2G4A抑制剂Pyrrophenon做对照，观察PNS对PLA2G4A下游的影响。将内皮细胞分为正常组、模型组、Pyrrophenon组、PNS组4组。Pyrrophenon组在造模前2 h按照12.86 μg/ml浓度加入 Pyrrophenone，PNS组加药情况同上。

1.5 RT－PCR法检测PLA2G4A mRNA表达量

3组细胞处理结束后用Trizol提取总RNA，通过cDNA逆转录试剂盒(Thermo Scientific)进行逆转录，之后扩增后在PCR检测仪上测定PLA2G4A的mRNA表达水平，结果用2－△△ct法表示。PCR引物如下，PLA2G4AF端:TTTGGGAGTTTCTGG CTCAC，R 端 TCTTCATTCTCGGTGCCTTT;内 参 F端: TATCGGCAATGCCTCTTGAATG，R端:AGCACT GTTGGCATAGAGG。

1.6 Western Blotting检测PLA2G4A蛋白表达

图1 各组细胞PLA2G4A mRNA表达量

图2 各组细胞PLA2G4A蛋白表达量

3组细胞处理结束后，使用裂解液收集细胞，用超声细胞破碎机破碎后4℃离心处理并收集上清，BCA法测定蛋白浓度。配聚丙烯酞胺胶后蛋白上样电泳并转膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜后加入1∶1000稀释的PLA2G4A山羊一抗(Sigma)4℃过夜，次日洗膜后加入1∶5000稀释的兔抗山羊二抗(Sigma)孵育显色并照相，使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.7 ELISA法测定AA、20－HETE、TXA2/PGI2表达

按照elisa试剂盒(Abcam)说明书加入细胞裂解液后离心提取上清，提取样本后测定各组AA、20－HETE、TXA2、PGI2浓度。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，数据以均差±标准差(¯±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞PLA2G4A mRNA表达

图1显示，与正常组比较，模型组PLA2G4mRNA表达明显上升(P＜0.01);与模型组比较;PNS组PLA2G4A mRNA的表达明显下降(P ＜0.01)。

2.2 各组BMECs PLA2G4A蛋白表达

图2显示，与正常组比较，模型组PLA2G4A蛋白表达量明显增加(P＜0.01);与模型组比较，PNS 组PLA2G4A蛋白表达明显降低(P＜0.01)。

2.3 Elisa法测BMECs的AA含量

图3显示，与正常组比较，模型组AA表达量明显增加(P＜0.01);与模型组比较，PNS组AA表达明显降低(P＜0.01)。

2.4 各组BMECs的TXA2/PGI2变化

图4显示，与正常组比较，模型组TXA2/PGI2比例增高(P＜0.05);与模型组比较，PNS组及抑制剂组TXA2/PGI2比例降低(P＜0.05)

2.5 各组BMECs的20－HETE含量

图5显示，与正常组比较，模型组20－HETE表达明显增高(P＜0.01);与模型组比较，PNS组及抑制剂组20－HETE表达明显降低(P＜0.01)

图3 各组细胞AA蛋白表达量

图4 各组细胞TXA2/PGI2

图5 各组细胞20-HETE表达量

3 讨论

PLA2G4A是胞浆型磷脂酶 A2的最主要亚型［6］，也是催化包膜磷脂水解生成AA的关键蛋白［7］。随着研究深入，其在肿瘤、炎症等领域的作用相继被发现［8－9］，但该蛋白在脑微血管内皮的研究却鲜有报道。

本课题组通过基因芯片筛查发现，BMECs经OGD造模后，PLA2G4A mRNA表达升高。因此本实验采用PCR、Western bolting法测定PLA2G4A的基因蛋白表达。结果显示该蛋白在造模后表达上调，提示其可能参与缺血后的病理进程。再以ELISA法检测其下游产物 AA、20－HETE、TXA2/ PGI2的表达情况

AA是细胞膜被PLA2G4A分解后的产物，在脑缺血时过表达，其下游代谢产物广泛参与凝血、炎症等多种病理进程。20－HETE是AA的代谢产物，具有强烈收缩血管作用，Marija Renic等发现抑制20－HETE表达可改善梗死后脑血流状态并减少梗死灶体积［10］。TXA2/PGI2是一对呈拮抗作用的AA代谢产物，分别具有促/抗凝血作用，其比例影响着血小板的黏附性，该比例使血小板黏附性增强，血液黏度增大。

实验结果显示，OGD造模后 BMECs中PLA2G4A基因、蛋白及其下游产物AA、20－HETE、TXA2、PGI2均过表达，提示PLA2G4A基因的高表达可能导致PLA2G4A蛋白的合成增加，加速胞膜水解生成AA。AA含量升高进一步导致其下游产物20－HETE、TXA2、PGI2过表达。20－HETE过表达会导致血管痉挛收缩，引起血管管径狭窄形状迂曲，增加血流阻力降低血液流速;TXA2/PGI2比例升高会使血小板黏附性增强，增加血液黏度，以上变化最终导致血液流动性变差，血液黏度变大，使脑缺血时脑血管内凝血及血栓形成率上升，也提示PLA2G4A的过表达可能是导致脑缺血后血管痉挛及血液高凝状态的内在机制之一。实验中，PNS则表现出下调PLA2G4A基因、蛋白及其下游产物AA、20－HETE、 TXA2/PGI2的作用，提示PNS对该通路的下调作用可能可以发挥缓解血管痉挛、降低血液黏度的效果，这可能是PNS在脑缺血治疗中发挥化瘀通络作用的机制之一。

［1］韩淑燕，李海霞，文宗曜，等.三七总皂苷对急性血瘀大鼠血液流变学的改善作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2009，3:183－187.

［2］李卫红，李澎涛，华茜，等.不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用［J］.中国中西医结合杂志，2007，2:131－134.

［3］朱元，李澎涛，李卫红，等.不同状态的大鼠星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞血脑屏障特征性酶的影响［J］.世界科学技术:中医药现代化，2012，2:1393－1398.

［4］N FLAMAND，S PICARD，L LEMIEUX，et al.Effects of pyrrophenone，an inhibitor of groupIV Aphospholipase A2，on eicosanoid and PAF biosynthesis n human neutrophils［J］.British Journal of Pharmacology，2006，149:385－392.

［5］郭晓谨，李兴广，李卫红，等.三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞氧化应激反应的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2014，2:215－216.

［6］ AKHLAQ A.FAROOQUI，WEI－YIONG，LLOYD A.Horrocks. Inhibitors of Brain Phospholipase A2 Activity:Their Neuropharmacological Effects and Therapeutic Importance for the Treatment of Neurologic Disorders［J］.Pharmacol Rev，2006，58:591－620.

［7］ YOSHIHIRO KITA，TAKAYO OHTO，NAONORI UOZUMI，et al.Biochemicalproperties and pathophysiologicalroles of cytosolic phospholipase A2s［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1761(11):1317－22.

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［10］ MARIJA RENIC，JUDITH A KLAUS，TOMOHIRO OMURA. Effect of 20－HETE inhibition on infarct volume and cerebral blood flow after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Cereb Blood Flow MeTab，2009，29(3):629.

The Effects of PNS on the PLA2G4A And it’s Downstream Products in Mimic Ischemic Brain Microvascular Endothelial Cells

SU Jing，LI Xing－guang△，LI Wei－hong△，HU Yan－hong，MA Jia－bao，ZHANG Sai，HU Jing－hong，WANG Shu－yan，KANG So－yeon
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective to evaluate the effects of Panax Notoginseng Saponins(PNS)on the PLA2G4A in Mimic ischemia brain microvascular endothelial cells(BMECs).Methods:primary rat BMECs were used and mimic cerebral ischemia in vitro was established by oxygen－glucose－deprived(OGD)method.OGD－induced BMECs were treated with PNS and Pyrrophenone(PLA2G4A inhibitor)respectively.The expression of PLA2G4A in mRNA and protein were detected by RT－PCR and Western blot methods.The expression of AA 20－HETE TXA2/PGI2 were detected by Elisa method.Results: both mRNA and protein expression of PLA2G4A in OGD－induced BMECs were down－regulated by PNS.AA 20－HETE TXA2/PGI2 were also decreased in administration group.Conclusion:PNS can down regulate the expression and function of PLA2G4A，which may be the internal mechanism of PNS’s Anticoagulant effect in cerebral ischemia.

Panax Notoginseng Saponins;brain microvascular endothelial cells;PLA2G4A;AA;20－HETE

R285.5

B

1006－3250(2017)02－0196－03

2016－07－19

国家自然科学基金资助项目(81273885)

苏 靖(1989－)，男，在读硕士，从事中药药理的临床与研究。

△

李兴广，男，教授，主任医师，硕士研究生导师，Tel:13621008162，E－mail:lixingguan@hotmail.com;李卫红，女，副教授，副主任医师，硕士研究生导师，Tel:010－64286982，E－mail:liweihong.403@163.com。