巨噬细胞移动抑制因子-173G/C基因多态性分布及其与脑梗死关系的研究

袁 宁， 许宏伟， 刘学军

巨噬细胞移动抑制因子-173G/C基因多态性分布及其与脑梗死关系的研究

袁 宁1，2， 许宏伟1， 刘学军2

目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)-173G/C基因多态性及其与脑梗死关系。 方法 筛选298例脑梗死患者及203例健康人群为研究对象，用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法检测MIF基因-173G/C多态性在脑梗死组和正常对照组的基因频率。结果 脑梗死组和对照组存在MIF基因-173G/C多态性，但MIF基因-173G/C基因型频率分布在两组间无显著性差异(χ2=1.795，P=0.180)。两种等位基因频率两组相比亦无显著性差异(χ2=0.362，P=0.548)。结论 MIF -173G/C多态性可能与脑梗死发生无关，G/C等位基因可能不是脑梗死发病的独立危险因素。

脑梗死； 巨噬细胞移动抑制因子； 基因； 多态性

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)于1966 年分别由Bloom和David两组科学家在用豚鼠进行迟发性超敏反应研究中发现，是机体内一种重要的细胞因子。其能促进巨噬细胞在炎症局部的聚集、增生、活化，增强其粘附、吞噬作用，促进分泌一些细胞因子，如IL-1、TNF-a、NO等，从而间接增强巨噬细胞的功能，并能抵消皮质类固醇激素对其它炎症细胞因子产生的免疫抑制作用，在机体的全身和局部炎症及免疫反应中起着重要的作用[1]。而炎症反应在动脉粥样硬化从起始发病到出现临床事件都发挥重要作用的认识已获得广泛认同，研究表明：血管发生动脉粥样硬化部位的MIF表达水平明显上调，且随着斑块的发展逐渐上升；相反，阻断MIF的表达则可以显著延缓动脉粥样硬化的发展并稳定斑块。尽管发现MIF在多种炎性疾病和动脉粥样硬化患者组织和血液中表达变化，但对于其基因多态性与健康人及患者中MIF表达的关系认识却很少。本文就MIF -173G/CSNPS与动脉粥样硬化性脑梗死的关系展开研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集脑梗死患者298例，平均年龄(64.48±11.48)岁，经临床及 CT和(或)磁共振成像(MRI)确诊(依照第四届全国脑血管病学术会议诊断标准)，排除心律失常、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的脑出血；排除肝、肾疾病、自身免疫性疾病、妊娠者、半年内曾有降脂治疗者。对照组为健康体检者共203例，平均年龄(61.27±7.80)岁，无血缘关系。

1.2 试验方法

1.2.1 引物 MIF -173G/C的PCR引物参照文献[2]，序列为PCR1：上游引物：5’-ACT-AAG-AAA-GAC-CCGAGGC-3；下游引物：5’-GGG-GCA-CGTTGG-TGT-TTA-C-3’；上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 DNA的制备及PCR扩增，基因型分析 (1)基因组 DNA的制备：采外周静脉血 2～3 ml用明胶沉淀红细胞，提取白细胞后用酚/氯仿抽提基因组DNA。(2)目的基因的 PCR扩增：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃充分延伸10 min。最后置于4 ℃终止反应。(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色，凝胶电泳成像分析系统内观察(4)酶切产物识别：MIF-173G/C多态性由内切酶Alu I识别，37 ℃消化10 h。然后均用琼脂糖凝胶(含溴化乙啶)电泳分离，紫外灯下照相后阅读。

1.3 统计学分析 全部资料均用SPSS 13.0 for windows软件包进行数据处理。

研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的组间比较采用χ2检验，并以比值比(OR)和95%可信区间(CI)表示相对风险度。计量资料指标均进行正态性检验，符合正态分布者组间比较用t检验，3组及3组以上比较用方差分析；不符合正态分布数据采用非参数检验。所有的统计检验均为双侧概率检验，以P<0.05为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑梗死组与对照组的临床数据比较 将脑梗死组患者与对照组进行一般数据的比较，两组在年龄、性别、吸烟史、饮酒史方面均无显著性差异(P>0.05)(见表1)。

表1 脑梗死组与对照组的一般数据比较

注：*代表与对照组相比P<0.05

2.2 MIF-173G/C 多态位点PCR产物酶切图谱分析 MIF-173G/C多态位点可被限制性内切酶Alu I识别。酶切后产生三种基因型：纯合子 GG、CC，杂合子 GC(见图1、图2)。

2.3 MIF-173G/C基因多态分布 CI组和对照组都有GG、GC、CC三种基因型，在研究总人群中(CI组+对照组)中的频率分别为：62.28%，32.73%，4.99%；等位基因G、C的频率分别为78.64、21.36。按Hardy-Weinberg平衡定律对研究人群进行了平衡检验(P>0.05)，证明我们选择的总研究人群基因频率能够代表群体的基因分布。

因CC基因型与GC基因型数量较少，将之合并为C等位基因携带者组，组间比较结果显示：MIF基因-173G/C基因型频率分布在两组间无显著性差异(χ2=1.795，P=0.180)。两种等位基因频率两组相比亦无显著性差异(χ2=0.362，P=0.548)(见表2)。

M：100 bp Maker，1-5泳道是PCR扩增产物

1、2杂合子GC型；3纯合子CC型；4、5、6、7纯合子GG型

3 讨 论

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是巨噬细胞自分泌的一种重要的前炎症因子。巨噬细胞不仅是产生MIF的主要细胞，也是MIF作用的靶细胞。MIF可能广泛参与了机体多种生理及病理生理学反应，包括炎症反应、免疫调节、脂肪发生、肾脏病变、肿瘤生成和皮肤创伤修复等。国内李敬[3]、刘运涌[4]发现MIF水平与动脉粥样硬化斑块的稳定性有关，李归宿[5]发现脑梗死患者MIF水平减低，且MIF水平高低与 动脉粥样硬化患者病情轻重、梗死灶体积大小密切相关。另有作者[6～8]发现在阿尔茨海默病、血管性痴呆、腔隙性脑梗死患者基线期、随访期患者中MIF水平均高于正常对照，认为其可以作为老年痴呆早期诊断和认知损伤程度判断的敏感指标。

表2 CI组与对照组MIF-173G/C基因型频率和等位基因频率比较

注：CI=脑梗死组，括号内表示各亚组例数在总人数中的比例。与对照组相比，P>0.05

多种研究证实MIF基因-173G/C多态性与阻塞性呼吸睡眠暂停[9]、膀胱癌[10]、风湿性关节炎[11]等多种疾病相关。本研究发现MIF基因-173G/C基因型频率分布在两组间无显著性差异(χ2=1.795，P=0.180)，两种等位基因频率两组相比亦无显著性差异(χ2=0.362，P=0.548)。下一步我们将对MIF-173G/C多态性与血糖、血脂代谢展开深入研究。目前对MIF-173G/C多态性研究结果不尽一致。Tereshchenko等[12]对捷克和俄罗斯的 459位心肌梗死患者，311位健康对照组进行了基因分型，发现该位点在病例组和对照组分布没有显著差别，但女性心肌梗死患者的GG基因型明显高于女性对照组，与冠心病存在相关性(P=0.027)。Herde[13]一项对德国人长达18 y的病例对照研究发现MIF-173G/C多态性和血清MIF 蛋白水平及2型糖尿病的发生无显著相关性。我们认为不同研究结果的差异可能与试验人群的差异包括饮食、环境和方法学的因素有关，当然与抽样误差、样本量大小等也有关联。

本研究首次报道MIF-173G/C基因多态性分布及其与脑梗死的关系，通过研究我们未见MIF-173G/C基因多态性与脑梗死有关，G/C等位基因不是脑梗死发病的独立危险因素。

[1]Zhang XL，Zheng XL，Dong FR. Nimodipine improves regional cerebral blood flow and suppresses inflammatory factors in the hippocampus of rats with vascular demennia[J]. Inl Med Res，2012，40(3)：1036-1045.

[2]Arikan C，Berdeli A，Ozgenc F，et al. Positive Association of Macrophage Migration Inhibitory Factor Gene-173G/C Polymorphism with Biliary Atresia[J]. J Pediatric Gastroenterol Nutrition，2006，42：77-82.

[3]李 敬. 血清巨噬细胞移动因子与脑梗死患者糖代谢异常的相关性研究[D]. 河北医科大学，2010.

[4]刘运涌，楚 兰. 血浆巨噬细胞游走抑制因子和颈动脉斑块性质与进展性脑梗死的关系[J]. 中华老年心脑血管病杂志，2012，6(14)：584-586.

[5]李归宿. 急性脑梗塞患者巨噬细胞移动抑制因子水平的动态变化及意义[J]. 医学信息，2011，24(8)：4928-4930.

[6]陈明磊，武 琪，楚 兰. 腔隙性脑梗死患者认知障碍变化与MIF相关性研究[J]. 中风与神经疾病杂志，2014，8(31)：701-703.

[7]韩冰莎，王丽娟，赵结皓，等. 阿尔茨海默病患者外周血巨噬细胞移动因子的表达[J]. 中国神经精神疾病杂志，2008，34(4)：201-204.

[8]Bacher M，Deuster O，Aljabari B，et al. The role of Macrophage migration inhibitory factor in Alzheimer’s disease [J]. Mol Med，2010，16(3)：116-121.

[9]Khalyfa A，Kheirandish-Gozal L，Capdevila OS，et al. Macrophage migration inhibitory factor gene Polymorphisms and plasma levels in children with obstructive sleep apnea [J]. Pediatri Pulmonol，2012，47(10)：1001-1011.

[10]Yuan Q，Wang M，Wang M，et al. Macrophage migration inhibitory factor gene Polymorphism and risk of bladder cancer in southern China：a case-control analysis[J]. Mol Biol Rep，2012，39(3)：3109-3015.

[11]Uamas-Covarrubias MA，Valle Y，Bucala R，et al. Macrophage migration inhibitory factor(MIF)：genetic evidence for participation in early onset and early onset and early stage rheumatoid arthritis[J]. Cytokine，2013，61(3)：759-765.

[12]Tereshchenko IP，Petrkova J，Mrazek F，et al. The Macrophage migration inhibitory factor gene Polymorphism in Czech and Russian patients with myocardial infarction[J]. Clin Chim Acta，2009，402(1/2)：199-202.

[13]Herde C，Klopp N，Baumert JM，et al. Effect of macrophage migration inhibitory factor(MIF)gene variants and MIF serum concentrations on the risk of type 2 diabetes：results from the MONICA/KORA Augsburg Case-Cohort Study 1984-2002[J]. Diabetologia，2008，51：276-284.

Relationship between MIF-173G/C single nucleotide polymorphism and atherosclerotic cerebral infarction.

YUANNing，XUHongwei，LIUXuejun.

(XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

Objective To study the relationship between MIF -173G/C single nucleotide polymorphism(SNPS) and atherosclerotic cerebral infarction(CI). Methods The genotypes for the tested MIF SNPs were detected by polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and DNA sequence. Results There existed -173G/C polymorphism of MIF in CI patients and controls，however，no significant differences were observed in genotypes and allele frequencies between CI patients and controls for MIF-173G/C polymorphism(P>0.05). Conclusion MIF-173G/C polymorphism has no significant correlation with CI patients and allele G/C isn’t an independent risk factor for CI.

Cerebral infarction； Macrophage migration inhibitory factor； Gene； Polymorphism

2016-11-20；

2017-02-13

(1.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008；2.湖南省脑科医院，湖南 长沙 410007)

刘学军，E-mail：707151907@qq.com

1003-2754(2017)03-0247-03

R743

A