过表达BCL-2对急性脑梗死大鼠神经功能的影响

彭静华， 金 飞， 张鸿日， 张育德， 闫俊强

过表达BCL-2对急性脑梗死大鼠神经功能的影响

彭静华1， 金 飞2， 张鸿日3， 张育德1， 闫俊强1

目的 探讨采用慢病毒介导Bcl-2在急性脑梗死大鼠脑组织过表达对神经功能的影响。方法 45只大鼠随机分为假手术组、模型组和治疗组。假手术组和模型组分别于手术前10 d通过颅内动脉给予慢病毒空载体，治疗组给予慢病毒Bcl-2过表达载体。在采用线栓法制作大鼠大脑中动脉脑梗死模型72 h后，分析大鼠脑组织梗死范围、脑细胞凋亡指数以及神经功能的变化。结果 慢病毒介导的Bcl-2表达质粒可在大鼠脑组织中表达，治疗组大鼠脑组织中Bcl-2的水平明显高于假手术组和模型组；与假手术组比较，模型组和治疗组脑组织神经细胞凋亡指数和脑组织梗死范围明显增加(P<0.05)，而治疗组神经细胞凋亡指数和脑组织梗死范围较模型组明显下降(P<0.05)；治疗组大鼠神经功能损伤评分较模型组明显下降(P<0.05)。结论 过表达Bcl-2可降低大鼠脑组织神经细胞凋亡水平，对神经具有一定保护作用，为临床急性脑梗死治疗提供了一定的参考依据。

脑梗死； Bcl-2； 细胞凋亡； 神经保护

急性脑梗死发病率高、致死率高，已经成为严重威胁人类健康的疾病类型之一[1]。急性脑梗死发作时，脑组织血液供应发生障碍，导致局部脑组织因缺血发生坏死、软化。但是在缺血中心不可逆坏死区域与正常脑组织之间存着缺血半暗带区，该区域的组织在功能上呈现可逆性损害，这部分组织细胞仍呈现正常的组织结构，但是在形态学上表现为凋亡状态[2]。而细胞的凋亡则是由基因调控细胞程序性死亡的过程，其中Bcl-2是一个重要的与细胞凋亡相关的蛋白，其由239个氨基酸组成，在抑制细胞凋亡过程中发挥着重要作用[3]。目前大量研究显示Bcl-2基因和蛋白在急性脑梗死患者脑组织中表达下调，导致脑梗死细胞凋亡水平明显增加，加剧了脑梗死患者神经功能损伤程度[4]。通过抑制脑梗死半暗带细胞的凋亡，则可达到保护神经功能的作用。在这一理论的基础上，鉴于Bcl-2的抑制细胞凋亡的特性，本研究在动物水平上分析了采用慢病毒介导Bcl-2载体在急性脑梗死大鼠脑组织特异性高表达对大鼠脑神经功能的影响，旨在为临床治疗急性脑梗死提供一定的理论依据。

1 资料和方法

1.1 实验仪器和材料 SD大鼠(180～200 g)购自上海斯莱克动物中心；HRP-羊抗鼠二抗购自北京中杉有限公司；Triozol购自Invitrogen公司；Bcl-2购自美国Santa公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物有限公司；TTC染液购自南京建成生物工程研究所。

1.2 急性脑梗死大鼠模型构建及处理 采用longa的方法[5]建立大鼠大脑中动脉脑梗死模型。在手术后2 h内大鼠表现出精神萎靡，同侧霍纳氏症，对侧前肢下垂，内收内旋，并自发性向患侧转圈说明建模成功。若无此表现说明构建模型失败，则剔除该大鼠。实验分为3组，假手术组、模型组和治疗组，每组15只。假手术组大鼠只分离血管不插线栓。假手术组和模型组分别于手术前10 d通过颅内动脉给予慢病毒空载体，治疗组给予慢病毒Bcl-2过表达载体。

1.3 TUNEL分析脑组织细胞凋亡水平 大鼠建模72 h后处死大鼠，脑组织采用OCT包埋，然后采用冰冻切片机将脑组织切成厚度为7 μm的切片，粘附于玻片上。然后按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。大体操作流程如下：玻片采用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)固定，用2 mg/ml的Proteinase K溶液处理玻片，然后滴加100 μl 1 × Equilibration Buffer于标本区域，孵育30 min后弃液体，在玻片上滴加50 μl TdT孵育缓冲液。37 ℃孵育60 min。PBS洗涤3次，每次5 min，用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。立即在荧光显微镜下分析样本。观察时标本放大400倍，随机选取梗死区周边的区域10个视野，计算凋亡细胞占总细胞的比例作为脑细胞的凋亡指数。

1.4 TTC染色分析脑组织梗死范围变化 大鼠建模后72 h立即处死，取脑组织做冠状切片，然后将切片置于2%的TTC磷酸缓冲液中37 ℃染色20 min。然后采用多聚甲醛固定，正常组织为红色，梗死组织为白色。并在显微镜下分离梗死组织与正常脑组织，用分析天平称取正常组织和梗死组织的湿重，梗死范围为梗死组织重量占梗死组织与正常脑组织总质量的百分数。

1.5 大鼠神经功能分析 假手术组、模型组和治疗组大鼠分别于术后24 h，48 h和72 h采用Bederson标准评分进行神经功能缺损分析[6]。无神经功能缺损症状计0分；不能完全伸展患侧前爪计1分；向患侧转圈计2分；向患侧倾倒计3分；不能自发行走且意识丧失计4分；死亡5分。

2 结 果

2.1 不同处理组大鼠脑组织Bcl-2表达水平比较 结果如图1所示，与假手术组和模型组比较，治疗组大鼠经慢病毒介导的Bcl-2载体在脑组织中表达高水平的Bcl-2蛋白。对3组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白的水平分析显示：治疗组大鼠脑组织中Bcl-2的表达水平明显高于假手术组和模型组(P<0.05)。

A：Western blot分析了3组大鼠脑组织Bcl-2表达水平；B：定量分析了3组大鼠脑组织Bcl-2表达水平

图1 3组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白的表达水平变化

2.2 3组大鼠脑组织神经细胞凋亡和脑梗死范围比较 大鼠建模后72 h脑组织细胞凋亡指数和梗死范围明显增加，而在过表达Bcl-2的大鼠脑组织中细胞凋亡指数降低，梗死范围较小(如图2A

和2C所示)。对凋亡水平和梗死范围进行定量分析显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中细胞凋亡指数和梗死范围显著增加(P<0.05)。而治疗组大鼠脑组织中细胞凋亡指数和梗死范围较模型组则显著性下降(P<0.05)，但是其水平仍然显著高于假手术组(P<0.05)(如图2B和2D)。

2.3 3组大鼠神经损伤程度比较 结果如表1所示，对3组大鼠神经损伤程度进行评定显示，模型组和治疗组大鼠在建模后神经损伤程度较假手术组明显增加，治疗组神经功能损伤程度明显低于模型组(P<0.05)，治疗组大鼠神经损伤程度仍然显著高于假手术组(P<0.05)。

表1 3组大鼠神经损伤程度比较

*：与假手术组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05

A：TUNEL分析3组大鼠脑细胞凋亡情况；B：定量分析3组大鼠脑细胞凋亡指数变化；C：TTC染色显示3组大鼠脑组织梗死范围情况；D：定量分析3组大鼠脑组织梗死范围

图2 3组大鼠脑组织细胞凋亡指数和梗死情况比较

3 讨 论

细胞凋亡是指细胞在一定生理或者病理条件下，有许多基因精密调控的程序化死亡过程，是细胞维持自我稳定的重要机制[7]。目前研究发现急性脑梗死过程中抑制缺血半暗带区域细胞凋亡是治疗急性脑梗死的关键，这部分细胞具有可逆性，可通过抑制细胞凋亡使其恢复功能。因此有效抑制该区域细胞的凋亡对降低脑组织细胞凋亡，降低神经功能损伤具有重要的意义[8]。 Bcl-2是细胞凋亡调控中主要的调控蛋白，是主要的凋亡抑制蛋白。但是研究发现在急性脑梗死患者血清中Bcl-2的表达水平明显下降，说明机体抗凋亡能力下降，细胞凋亡的稳态被打破[9]。因此通过重建机体脑组织中凋亡稳态环境，可能抑制脑梗死半暗带区域细胞的凋亡，对脑组织起到保护作用。在这一思想的指导下，我们分析了大脑脑组织过表达Bcl-2对急性脑梗死大鼠脑组织凋亡的影响。本研究采用慢病毒介导Bcl-2在大鼠脑组织中过表达Bcl-2，Western bolt显示治疗组大鼠脑组织中Bcl-2的表达水平明显增加。说明采用慢病毒作为传输载体可实现Bcl-2在脑组织中的过表达。

Bcl-2高表达抑制了急性脑梗死大鼠脑组织细胞的凋亡[10]。由于凋亡被抑制，脑组织半暗带凋亡可能发生逆转，因此有可能减少脑组织梗死面积。我们研究结果证实Bcl-2大鼠脑组织脑组织梗死范围较模型组明显下降，这一结果凋亡指数下降的现象一致。脑组织梗死面积减小，细胞凋亡水平减少，对大鼠神经功能评定发现Bcl-2大鼠神经功能的缺损程度明显低于模型组。值得注意的是Bcl-2的高表达对凋亡的抑制有一定的限度，Bcl-2高表达的大鼠脑组织细胞凋亡水平、梗死范围以及神经功能缺损程度明显高于假手术组大鼠。

综上所述，急性脑梗死大鼠脑组织高表达Bcl-2可显著抑制脑细胞凋亡、降低脑梗死范围，保护神经功能，本研究为急性脑梗死治疗药物的研发提供了一定的理论基础。

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Neuroprotective effects of Bcl-2 overexpression in rats with acute cerebral infarction

PENGJinhua，JINFei，ZHANGHongri，etal.

(DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

Objective To investigate the neuroprotective effects of Bcl-2 overexpression in rats with acute cerebral infarction. Methods 45 rats were randomly divided into sham group(only isolated vascular suture unplugged，n=15)，model group(n=15)and treatment group(n=15). Rats in sham group and model group were treated with empty vector mediated by lentiviral. Rats in treatment group were treated with Bcl-2 overexpression mediated by lentiviral. After middle cerebral artery infarction model were constructed at 72 h，infarct size and neural function defect of brain cell were analyzed. Results Bcl-2 protein mediated by lentiviral can be expressed in rat brain. Bcl-2 protein levels in treatment group significantly increased than that of the sham group and model group(P<0.05). Apoptosis index and infarction range of brain tissues in model group and treatment group significantly enhanced than that of sham group(P<0.05). Apoptosis index and infarction range of brain tissues in treatment group significantly decreased than that of model group(P<0.05). Compared with sham group，neural function defect scores in model group and treatment group significantly enhanced(P<0.05)，while those scores in treatment group significantly decreased than that of model group(P<0.05). Conclusion Overexpression of Bcl-2 can reduce the level of apoptosis in rat brain nerve cells and have a protective effect on nerve provides a frame of reference for the clinical treatment of acute cerebral infarction.

Acute cerebral infarction； Bcl-2； Cell apoptosis； Neuroprotective effect

2016-09-15；

2017-02-26

国家自然科学基金(No. U1304809)；河南洛阳市青年医学科技创新联合专项资金项目(No. 1503008A-15)

(1.河南科技大学第一附属医院神经内科，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学第一附属医院第一药房，河南 洛阳 471003；3.河南科技大学第一附属医院神经外科，河南 洛阳 471003)

彭静华，E-mail：jinghuapeng@126.com

1003-2754(2017)03-0217-04

R743

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