气相色谱串联质谱法测定基因毒性杂质3,4-二氯苯胺的方法学验证

李靖坤，王珊珊，陈相峰＊，王晓利，林云良

（山东省分析测试中心，山东 济南 250014）

气相色谱串联质谱法测定基因毒性杂质3,4-二氯苯胺的方法学验证

李靖坤，王珊珊，陈相峰＊，王晓利，林云良

（山东省分析测试中心，山东 济南 250014）

文章建立了一种气相色谱串联质谱法测定吉非替尼中3,4-二氯苯胺的方法。本方法采用多反应监测（MRM）扫描模式，能够有效的降低基质效应，在1～100ng/mL 范围内3,4-二氯苯胺线性关系良好，化合物相关系数均大于0.990，回收率在92.53%～118.15%，目标化合物峰面积(RSD%)值均小于10.0%。可满足吉非替尼中基因毒性杂质3,4-二氯苯胺的测定要求。

GC/MS/MS；基因毒性杂质；3,4-二氯苯胺

1 前言

吉非替尼（易瑞沙）是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂[1]，是一种新型的治疗癌症的药物，可以通过抑制肿瘤发生发展过程中细胞信号的传导来抑制恶性肿瘤细胞的增生[2-4]，目前已在多个国家批准上市用于癌症的治疗[5]。吉非替尼常被应用于治疗已经接受了化学治疗或者是不适于化疗的晚期的或者转移性非小细胞肺癌。在制备吉非替尼的工艺流程中往往会存在溶剂残留问题，而这些残留的溶剂中有许多是基因毒性杂质。基因毒性杂质在低浓度时就可造成人体的遗传物质的损伤[6-7]，从而导致基因突变[10-12]并可能促使肿瘤的发生。近几年来，随着基因毒性杂质法规的逐步完善，美国食品和药物管理局( FDA) 和欧洲药物管理局( EMEA)等部门对基因毒性杂质的监管要求越来越高。药物中基因毒性杂质如果控制不当，可能会导致临床隐患，同时也会影响新药上市时间。欧洲EMEA和美国FDA 均提出采用“毒理学关注阈值”( thresh-old of toxicological concern，TTC) 作为基因毒性杂质的可接受限度[8-9]。本文对吉非替尼中3,4-二氯苯胺基因毒性杂质进行了研究。

2 实验部分

2.1 材料、试剂与仪器

分析仪器采用Agilent 7890A-7000B气相色谱质谱联用仪，色谱柱采用DB-5 30 m×0.25 mm×0.25μm, 固定相为5%-苯基-甲氧基聚硅氧烷，柱温采用起始温度80℃，维持0分钟，以15℃每分钟的速率升温至250℃，维持0.5分钟。进样口温度设定为220℃，分流模式为不分流，载气采用高纯氦气，流速为1.0 ml/min，进样体积为1.0 μl，离子源温度为230℃，采集模式为多反应监测采集模式（MRM），定量离子对为166/99，定性离子对为166/90，碰撞能为25eV。超声使用KQ2202型数控超声波清洗机。

图1 全扫描色谱图Fig.1 Full scan chromatogram

图2 3，4-二氯苯胺质谱图Fig.2 3,4-dichloroaniline mass spectrogram

2.2 溶液配制

稀释溶剂采用甲醇。供试品溶液采取吉非替尼40mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，超声2min，作为供试品溶液。对照品贮备液取3，4-二氯苯胺100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液1。精密量取1.0ml贮备液1，置100ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，贮备液2。精密量取1.0ml 贮备液2，置100ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2.0ml，置100ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

3 结果与分析

3.1 专属性研究

专属性实验要求单独进空白溶液，证明该溶液对被测物测试无干扰，然后取对照品贮备液进样。结果见图1、图2，由色谱图可以看出，空白溶液对杂质检测无干扰，供试品中其他杂质对3,4-二氯苯胺的检测无干扰。

3.2 标准曲线

精密量取适量对照品储备液，配置成100ng/mL、50ng/ mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL浓度梯度的标准溶液，取上述各线性溶液各1μL 进样，记录峰面积。以目标物浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。获得化合物的标准曲线及相关系数。得到2,4 -二氯苯胺的回归方程y=3.1736x+4.358，其相关系数为0.9984，说明方法线性良好。

3.3 检出限及定量限

准确配制被测物标准溶液，逐步稀释至一定浓度并进样，其信噪比（S/N）为3左右时的样品浓度即为检测限浓度，检测限连续进3针；信噪比在10～15的样品的浓度即为定量限浓度，定量限连续进样6针；检测限浓度与样品理论浓度的比值即为检测限；定量限浓度与样品理论浓度的比值即为定量限，计算对应的峰高RSD应≤10.0%，定量限为2.5ppm，检出限为1ppm。结果见表1。

表1 检出限及定量限结果Table 1 Detection limit and the quantitative results

3.4 方法回收率及精密度

精密称取吉非替尼40mg，置10ml量瓶中，再精密加入对照品储备溶液0.16mL，再加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，超声2min。取上清液作为80%限度测试溶液。同上述方法，做100%和120%限度测试溶液分析。由表3可见，回收率在92.53%～118.15%之间，回收率的相对标准偏差为4.86%。方法的精密度为7.68%。回收率和精密度实验结果良好，符合方法学的要求。

表2 方法的加标回收率Table 2 The method of standard addition recovery rate

3.5 样品检测

精密称定1#、2#和3#样品各40mg，置于10mL的量瓶中，超声2min，摇匀，按照上述方法分析，分别测三次。三批样品中均未检出该基因毒性杂质，可见所分析样品安全。

4 结论

本方法采用气相色谱串联质谱法测定吉非替尼中3,4-二氯苯胺基因毒性杂质，方法灵敏度高，基质干扰小，适合应用到实验室中药物基因毒性杂质的日常检测。

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Validation of GC-MS/MS Method for The Analysis of Genotoxic Impurity 3,4-Dichloroaniline

Li Jingkun, Wang Shanshan, Chen Xiangfeng*, Wang Xiaoli, Lin Yunliang
(Shandong Analysis and Test Centre, Jinan 250014 Shandong China)

A gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) method was developed for the determination of 3,4-Dichloroaniline in Gefitinib. The matrix effect was effectively reduced by multiple reaction monitoring (MRM) mode. The developed method has good linear relationship in the concentration range of 1～100 ng/mL with correlation coefficient above 0.990. The recoveries of target analyte ranged from 92.53% to 118.15%. The precision of method (RSD%) were less than 10.0%. This method can be used to the analysis of 3,4-Dichloroaniline in Gefitinib.

GC/MS/MS, Genotoxic impurity, 3,4-Dichloroaniline

TS255.7

A

10. 11967/ 2017150112

TS255.7

A DOI：10. 11967/ 2017150112

李靖坤 , 山东省分析测试中心, 硕士研究生, 研究方向: 药物分析。

陈相峰, 副研究员，博士, 山东省分析测试中心, 研究方向: 复杂体系质谱分析方法、技术与应用研究 E-Mail: xiangfchen@aliyun.com.

基金支持: 山东省科学院科技发展基金 (科基合字(2012)第11号)。