复方中草药制剂抗氧化及抗肿瘤作用的研究

路子佳，党磊，张美姿，谢瑶＊

（1.北京东方红航天生物技术股份有限公司；2.航天神舟生物科技集团有限公司，北京100190）

复方中草药制剂抗氧化及抗肿瘤作用的研究

路子佳1，党磊2，张美姿2，谢瑶1＊

（1.北京东方红航天生物技术股份有限公司；2.航天神舟生物科技集团有限公司，北京100190）

目的研究以灵芝、红景天、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为主要原料制成的复方中草药胶囊的抗氧化及抗肿瘤作用。方法以不同浓度的复方中草药胶囊进行总抗氧化能力试验（ABTS）、羟自由基清除试验、Hacat细胞内活性氧（ROS）水平试验、Jurkat细胞增殖抑制试验以及Jurkat细胞凋亡试验。结果该复方中草药胶囊具有显著的抗氧化能力，在2 μg/ml剂量下，羟自由基清除率可达35.64%±0.32%，并能够显著降低UVB引起的Hacat细胞内的ROS水平（P＜0.01）；在0.1 μg/ml剂量下，可以有效地抑制Jurkat细胞增殖，抑制率可达30%以上，并具有显著的促凋亡作用（P＜0.01）。结论该复方中草药胶囊具有一定的抗氧化及抗肿瘤的作用。

灵芝；红景天；蝙蝠蛾拟青霉菌粉；抗氧化；抗肿瘤

伴随着人们收入的增加、健康意识的提高，越来越多的人更加关注自身的健康，由此衍生了巨大的健康市场的需求，消费观念的转型、老龄化的困境、政策的规范等多重因素助力着保健品行业整体规模的提升。2009年至今，保健食品行业进入了有序发展的新时期，2015年中国保健品市场销售额为1851亿元，同比增长10.5%，但我国现阶段保健品人均消费水平还相对较低，2015年同期，美国、日本的人均消费分别为140美元、105美元，均超过中国人均23.8美元水平的近5倍，提升空间大。目前，国内缺乏具有全国知名度的保健品品牌，而国际品牌的大量涌入必将带来国内保健品产业改革，而以传统中医药学为基础的，依据中医“治未病”理论，开发研制中草药类保健品也将成为中国保健食品的独特优势。据统计，2015年中草药类保健品增速仅次于运动营养类（16.29%），达到12.51%。

有一部分中药既可用于治病，又是很好的食物，即药食同源中药；还有一部分中药虽不作为一般食物食用，但可作为保健食品的原料，这两部分中药使用安全且具有明显功能，为研制具有显著优势特色的中国保健品奠定了坚实的基础，将为国际市场提供前所未有的功能独特或优势显著的产品，也将为人类健康和产业发展作出前所未有的贡献[1]。中药保健品对人体功能失调有明显调整作用，且食用安全[2]，在公众日常生活中扮演越来越重要的角色[3]。

灵芝（Ganoderma）为多孔科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，性甘平，归心、肺、肝、肾经，具有补气安神，止咳平喘等作用。灵芝子实体中共含有多糖类、三萜类、甾类、酸脂类、生物碱等物质共150余总，具有提高免疫调节能力[4-5]、抑制肿瘤[6-7]、抑制氧自由基[8-9]、保肝解毒[10]等作用。红景天（Rhodiola）为景天科大花红景天的干燥根和根茎，性甘苦平，归肺、心经，具有益气活血，通脉平喘等作用。红景天中含有红景天苷、酪醇、黄酮、没食子酸乙酯、维生素C等化学成分，具有抗疲劳[11]、耐缺氧[12]、调节免疫力[13]、抑制肿瘤等作用[14-15]。蝙蝠蛾拟青霉菌（Paecilomyces hepialid）粉的化学成分主要包括虫草素、腺苷、鸟苷、尿苷等核苷类物质以及虫草多糖、甾醇类、氨基酸、维生素和微量元素等[16-17]，具有抗疲劳、抗炎、抗癌、降糖、调节免疫力等作用[18-20]。

以红景天、灵芝、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为主要原料，研制出一种具有增强免疫力功能的复方中草药胶囊。通过Hacat细胞内活性氧（ROS）水平试验、羟自由基清除试验、总抗氧化能力试验（ABTS）、Jurkat细胞增殖抑制试验以及Jurkat细胞凋亡试验研究该复方中草药胶囊的抗氧化及抗肿瘤作用，为中药复方保健制剂的开发提供理论依据和实验基础，为消费者提供更加安全有效的保健食品具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 受试样品

以红景天、灵芝、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为主要原料的复方中草药胶囊规格为0.45 g/粒，每100g中含红景天苷620 mg，腺苷44 mg。

灵芝，产地山东，采购于北京峰顺康医药有限公司，按干燥品计算，含灵芝多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.90%；按干燥品计算，含三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于0.50%，符合《中华人民共和国药典》2015版一部中对灵芝的要求。

红景天，产地西藏，采购于北京峰顺康医药有限公司，按干燥品计算，含红景天苷（C14H20O7）不得少于0.50%，符合《中华人民共和国药典》2015版一部中对红景天的要求。

蝙蝠蛾拟青霉菌粉，来源于江苏神华药业有限公司，其多糖（以无水葡萄糖计）≥4.0%，腺苷≥2 mg/g。

其制备方法为：将符合中国药典质量要求的灵芝、红景天进行粉碎，按1:0.7质量比混合，加10倍量水煎煮提取2次（第一次煎煮前先浸泡30 min），每次2 h，过滤获得水提取液，进行减压浓缩、真空干燥获得干浸膏，粉碎过筛后，按2.62:1.0:0.85质量比与蝙蝠蛾拟青霉菌粉、糊精混合，混合20 min得混合粉A，按配方投料量的0.67%加入硬脂酸镁混合20 min后，得总混合粉，进行填充胶囊、抛光、包装检验等工序制成复方中草药胶囊。

1.2 主要试剂

人体永生化上皮细胞（Hacat细胞）、淋巴细胞白血病细胞（Jurkat细胞） 北京协和细胞资源中心；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒 碧云天生物技术研究所；羟自由基测试盒、Annexin-FITC试剂盒 南京建成生物工程研究所；CCK-8检测试剂盒 DOJINDO公司；RPMI1640培养基、DMEM高糖培养基、FBS、Antibiotic-antimycotic、0.25% Trypsin Life Technologies 公司。

1.3 主要仪器

THERMO细胞培养箱、流式细胞仪、Bio-rad酶标仪、THERMO荧光分析仪、THERMO生物安全柜、UVB辐射灯（波峰为312nm Spectroline）、BT25S型十万分之一电子分析天平等。

1.4 试验方法

1.4.1 样品前处理及细胞培养

取50 μg复方中草药胶囊内粉末，加入1 mL75%的乙醇，超声处理2 h，取上清液，0.2 μm滤膜过滤后备用。

Hacat细胞培养：使用DMEM培养基，含10%的FBS及1%的抗细菌和真菌的抗生素，37 ℃、5% CO2的培养箱培养。

Jurkat细胞培养：使用RPMI1640培养基，含10%的FBS及1%的抗细菌和真菌的抗生素，37 ℃、5% CO2的培养箱培养。

1.4.2 活性氧（ROS）试验

建立紫外线（UVB）照射的HacaT细胞损伤模型，通过样品对UVB照射后Hacat细胞中ROS浓度的影响，从而验证样品对人体上皮细胞的UVB氧化损伤的防护作用。

Hacat细胞以4×104/孔接种于12孔板中，培养至细胞融合80%以上时进行UVB辐照处理。设5个试验组：阴性对照组（-UVB）、UVB组、UVB+样品组（样品浓度分别为0.1、0.2、0.4 μg/mL）。细胞接种24 h后，吸去培养液，加入PBS洗一遍后，再把PBS去除干净，将细胞放入紫外辐照箱中进行UVB处理，辐照剂量为10 mJ/cm2（辐照时间：5 s），阴性对照组不进行辐照。取出细胞进行培养，UVB+样品组加入含不同浓度的样品溶液的完全培养基培养，24 h后使用ROS检测试剂盒进行细胞内ROS水平的检测。荧光信号使用荧光分析仪进行，激发波长为485 nm，发射波长为538 nm。同时，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量，从而对结果进行校正。

1.4.3 羟自由基清除试验

羟自由基是活性氧中最活泼的自由基之一，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化、蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。减少此类自由基，可达到预防衰老，心血管疾病及抗癌等作用。使用羟自由基测试盒进行样品羟自由基清除能力的检测，设置5个试验组：空白组（0.4 mL ml蒸馏水）、标准组（0.2 mL蒸馏水+0.2 mL 0.03% H2O2标准应用液）、对照组（0.2 mL蒸馏水+0.2 mL底物应用液）、样品组（0.2 mL样品溶液+0.2 mL底物应用液、样品液浓度分别为0.5、1.0、2.0 μg/mL），具体操作方法参见羟自由基测试盒的说明书，酶标仪540 nm波长测定光吸收。

1.4.4 总抗氧化能力试验

按总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）要求配置ABTS工作液及过氧化氢酶工作液，trolox为阳性对照组，各样品组浓度分别为0.5、1.0、2.0 μg/mL。按试剂盒说明书要求将ABTS工作液、过氧化氢酶工作液、样品及trolox浓度梯度样品加入到96孔板中，室温孵育6 min后，用酶标仪进行检测，检测波长为405 nm。

1.4.5 细胞增殖抑制试验

Jurkat细胞以2×104/孔接种于24孔板中，加入含有不同浓度样品溶液的培养基（样品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1 μg/mL），分别处理48 h、96 h后，离心去除上清液，加入200 μL含10% CCK-8的新培养液，37 ℃温水浴30 min左右，取上清于96孔板中，使用酶标仪450 nm波长检测上清液的OD值。

1.4.6 细胞凋亡试验

Jurkat细胞以1×105/孔接种于6孔板中，加入含有不同浓度样品溶液的培养基（样品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1 μg/mL），处理48 h后，使用Annexin-FITC试剂盒进行操作，使用流式细胞仪（FACS）进行检测分析。

1.5 试验数据统计

试验重复3次，结果以平均值±SD表示，所有数据进行齐性检验，并作t检验和方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 样品对Hacat细胞内ROS水平的影响

Hacat细胞内ROS水平试验结果详见表1。

表1 复方中草药胶囊对Hacat细胞内ROS水平的影响( ±SD)Table 1 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the level of ROS in Hacat cells ( ±SD)

外部环境可引起体内ROS水平的增加，如UV、抽烟以及身体衰老等原因。由表1可知，使用UVB对Hacat细胞进行照射处理，与-UVB组比较，UVB照射使细胞内ROS水平显著升高（P＜0.01）；与UVB组比较，加入样品溶液后的各组细胞中ROS含量明显降低，差异具有显著性（P＜0.05），且与样品剂量有一定的相关性，当剂量达到0.2 μg/mL或更高时，加入样品的细胞内ROS的水平与不加样品的细胞内ROS的水平相比，其差异具有极其显著性（P＜0.01）。表明该复方中草药胶囊可以有效降低UVB引起的细胞中ROS的水平。

2.2 样品的羟自由基清除能力

羟自由基清除试验结果详见图1。

图1 复方中草药胶囊对羟自由基清除能力的影响( ±SD)Figure 1 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the hydroxy radical scavenging capacity ( ±SD)

由图1可知，该复方中草药胶囊具有一定的羟自由基清除能力，并且表现出剂量-效应关系。在2.0 μg/mL剂量下，羟自由基清除率可达到35.64%±0.32%，表现出较强的清除羟自由基活性能力。

2.3 样品的总抗氧化能力

总抗氧化能力试验结果详见图2

图2 复方中草药胶囊的总抗氧化能力( ±SD)Figure 2 The total antioxidant capacity of the compound Chinese herbals capsule ( ±SD)

在正常代谢或光老化过程中细胞会产生大量活性氧，如不能及时清除，会引起皮肤细胞下游一系列的放映，最终引起皮肤老化。ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制。Trolox是一种维生素E的类似物，具有和维生素E相近的抗氧化能力，可用作其它抗氧化物总抗氧化能力的参照品，其它物质的抗氧化能力用其抗氧化能力与Trolox相比的倍数来表示。

由图2可知，加入样品后，ABTS+的产生明显被抑制，样品的抗氧化能力与浓度呈线性关系。在2.0 μg/mL剂量下，样品抗氧化能力可达到Trolox的2.07±0.03倍。表明该复方中草药胶囊具有显著的抗氧化能力。

2.4 样品对Jurkat细胞增殖的影响

Jurkat细胞增殖抑制试验结果详见表2。

表2 复方中草药胶囊对Jurkat细胞增殖率的影响( ±SD)Table 2 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the proliferation inhibition rate of the Jurkat cell

由表2可知，0.025、0.05、0.1 μg/mL三个剂量组对Juarkat细胞具有增值抑制作用，且随浓度的增高，抑制作用也相应增强。在0.1 μg/mL浓度下，作用96 h，高剂量组与阴性对照组相比，抑制率可高达30%以上。表明该复方中草药胶囊可以有效抑制Jurkat细胞的增殖。

2.5 样品对Jurkat细胞凋零的影响

Jurkat细胞凋亡试验结果详见图3。

图3 复方中草药胶囊对Jurkat细胞增殖率的影响( ±SD)Figure 3 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the apoptosis rate of the Jurkat cell ( ±SD)

由图3可知，当达到一定浓度时，样品对Juarkat细胞的凋亡具有促进作用，且随浓度的增高，细胞的凋亡率也随之增高。在0.1 μg/mL浓度下，作用48 h，细胞早期凋亡率由对照组的10.42%增加至14.29%，具有极其显著性差异（P＜0.01）。表明该复方中草药胶囊可以有效促进Jurkat细胞的增殖凋亡。

3 结论

本文从细胞试验方面对以红景天、灵芝、蝙蝠蛾拟青霉菌粉为主要原料的复方中草药胶囊进行抗氧化作用、抗肿瘤作用的研究。以0.1、0.2、0.4 μg/mL剂量的该复方中草药胶囊处理经UVB照射的Hacat细胞，能显著降低由UVB引起的细胞内ROS含量的水平，当剂量达到0.2 μg/mL或更高时，UVB+样品组与UVB组比较，其差异具有极其显著性（P＜0.01）；以0.5、1.0、2.0 μg/mL剂量的该复方中草药胶囊进行羟自由基清除率检测及总抗氧化能力检测，在2.0 μg/ mL剂量下，羟自由基清除率可达到35.64%±0.32%，总抗氧化能力可达到Trolox的2.07±0.03倍；以0.025、0.05、0.1 μg/ mL剂量的该复方中草药胶囊处理Jurkat细胞，在0.1 μg/mL浓度下，作用48 h，细胞早期凋亡率由对照组的10.42%增加至14.29%，具有极其显著性差异（P＜0.01），作用96 h，细胞增殖抑制率可高达30%以上。由此可见，复方中草药胶囊在细胞水平具有显著地抗氧化作用及抗肿瘤作用，且随浓度的增加，作用也逐渐越强。本研究为中药复方保健制剂的开发提供理论依据和实验基础，为消费者提供更加安全有效的保健食品具有重要意义。

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Study on anti-oxidation e ff ect and anti-tumor e ff ect of the compound Chinese herbals

Lu Zijia1, Dang Lei2, Zhang Meizi2, Xie Yao1*
(1.Beijing dawn Aerospace Bio-Tech Co. Ltd; 2. Shenzhen Space Biotechnology Group, Bejing 100190, China)

ObjectiveTo study the anti-oxidation effect and anti-tumor effect of the compound Chinese herbals capsule, the capsule was made up of ganoderma, rhodiola, paecilomyces hepialid powder and other materials.MethodsWith different concentrations of t the compound Chinese herbals capsule, total antioxidant capacity test (ABTS), hydroxy radical scavenging test, the level test of reactive oxygen species (ROS) in Hacat cells, Jurkat cell proliferation inhibition test and Jurkat cell apoptosis test were conducted respectively in order to assess the anti-oxidation effect and anti-tumor effect.ResultsThe compound Chinese herbals capsule has obvious antioxidant ability，under the dose of 2 μg/ml, the scavenging rate of hydroxyl radical was 35.64%±0.32%, and could significantly reduce the level of ROS induced by UVB in Hacat cells(P＜0.01); under the dose of 0.1 μg/ml, the proliferation of Jurkat cells could be inhibited effectively, the inhibition rate could more than 30%, and the compound Chinese herbals capsule could significantly promote the apoptosis of the Jerkat cell (P＜0.01).ConclusionThe compound Chinese herbals capsule has the function of anti-oxidation and anti-tumor.

Ganoderma; Rhodiola; Paecilomyces hepialid powder; Anti-oxidation; Anti-tumor

R284

A

10. 11967/ 2017150113

R284

A DOI：10. 11967/ 2017150113

路子佳(1985-)，女，工程师，硕士，研究方向：保健食品研究与开发。

⋆通信作者：谢瑶(1982-)，女，工程师，博士，研究方向：保健食品研究与开发。Email：30993444@qq.com.