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磁珠分离结合质谱分析黏多糖病Ⅰ型患者尿液多肽谱

2017-04-12苑晓舟孟岩梁爽姜文灿葛素君段晋燕王成彬

生命科学仪器 2017年1期
关键词:磁珠多肽尿液

苑晓舟,孟岩,梁爽,姜文灿,葛素君,段晋燕,王成彬

(1.中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;2. 中国人民解放军总医院儿童医学中心, 北京,100853)

磁珠分离结合质谱分析黏多糖病Ⅰ型患者尿液多肽谱

苑晓舟1,孟岩2,梁爽1,姜文灿1,葛素君1,段晋燕1,王成彬1

(1.中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;2. 中国人民解放军总医院儿童医学中心, 北京,100853)

目的研究黏多糖病Ⅰ型(MPSⅠ)患者尿液小分子多肽谱,寻找对MPSⅠ型诊断的新方法。方法利用弱阳离子磁珠纯化(magnetic beads based weak cation exchange chromatography,MB-WCX)系统结合基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)的方法,检测8例于解放军总医院儿童医学中心确诊的MPSⅠ型患者(疾病组)和10例本院查体人员(健康对照组)的尿液标本,获得尿液小分子多肽谱,应用ClinProtTM软件进行数据分析,找出差异多肽峰,并绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线),对比曲线下面积(AUC)、敏感度和特异性。结果质荷比1000-10000之间,两组尿液标本共筛选出7个具有统计学差异(P<0.05)多肽差异峰。其中在疾病组中表达上调的有4个峰,表达下调的3个峰。AUC面积大于0.9的多肽质荷比为:1069.6(0.982)和3217.3(0.946),两者的特异性均为87.4%,敏感性均达到100%。结论MB-WCX联合MALDITOF-MS检测技术可获得MPSⅠ型患者和健康人的尿液差异多肽谱,为MPSⅠ型辅助诊断提供了一种无创的新方法。

黏多糖病Ⅰ型;弱阳离子磁珠;基质辅助激光解析电离-飞行时机质谱;多肽;尿液

粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,MPS)属溶酶体贮积病(lysosomal storage disease,LSD)中最常见的一种类型,是由于溶酶体内水解酶缺陷,导致粘多糖(glycosaminoglycans,GAGs)在各组织器官累积而致病的遗传代谢性疾病[1]。其中粘多糖病Ⅰ型是我国较常见的类型,发病原因是由于α-L-艾杜糖苷酶(IDUA)活性缺乏,致使其底物硫酸皮肤素(DS)和硫酸肝素(HS)贮积无法降解[2]。由于早期诊断的不及时,会导致不可逆的发育、神经、生理的改变。但是,该病现有的检测方法存在一些不足:尿液中GAG含量检测准确性较低,不能鉴别疾病类型[3];酶活性检测和基因检测不便于常规开展。因此,亟需探索新的生物标记物帮助对黏多糖贮积症进行早期诊断。本研究旨在利用弱阳离子磁珠(weak cation exchange magnetic beads,MBWCX)纯化试剂和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF),对MPSⅠ型患者尿液中小分子多肽谱作初步研究,寻找差异多肽峰,为诊断MPSⅠ型寻求新途径。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 对象

选取2015年3月~2016年4月在解放军总医院小儿内科遗传咨询门诊就诊的粘多糖病Ⅰ型患者8例纳入疾病组,其中男性5例,女性3例,平均年龄(11±5.0)岁。全部患者均符合粘多糖病的诊断标准,即具有特殊面容,骨骼发育畸形,肝脾肿大,角膜混浊等临床表现,且患者白细胞中IDUA活性显著低于正常参考值,以及基因检测发现相关突变位点,可确诊。选取同期健康体检儿童10例作为对照组,其中男性6例,女性4例,平均年龄(10.3±4.5)岁。本研究经医院伦理委员会批准,所有患者及健康对照人员均签署知情同意书。

1.1.2 仪器和试剂

弱阳离子纳米磁珠试剂盒及其缓冲体系、α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid, HCCA)、点样靶均购自北京毅新博创生物科技有限公司;丙酮、甲醇、异丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等购自美国Sigma公司,均为进口HPLC 级;其他材料购自德国Eppendorf 公司。Milli-Q 超纯水系统,为美国Millipore 公司产品;MicroCL 21高速离心机,由美国Thermo Fisher科技公司生产,MALDI-TOF-MS仪,由毅新博创公司生产。

1.2 方法

1.2.1 尿液收集和处理

收集受试者清晨中段尿50ml,然后4℃ 3 000r /min 离心5 min, 将分离的上清尿标本分装于离心管中,置-80℃冰箱保存待用。

1.2.2 尿液多肽提取

-80℃冰箱中取出尿标本,4℃ 12 000 r /min离心3 min,取上清液用MB-WCX 磁珠处理,步骤如下:① 4℃冰箱取出磁珠试剂盒,手动上下颠倒,使磁珠混匀。取200 ul 八连排样品管置于孔板上,依次加入10 ul 磁珠、 95 ul 磁珠结合缓冲液(CB)和10 ul 尿液样本,用排枪上下缓慢吸打混匀,避免气泡产生,在室温静置5min。② 将样品管在磁珠分离器上静置1min,磁珠富集到管底并贴壁,与悬浮的液体分离,液体应该变为澄清。吸去上清的液体,枪头接触磁珠对侧管底,避免吸走磁珠。③ 将样品放入孔板中,加入100 ul磁珠清洗液缓冲液(CW),用排枪上下缓慢吸打混匀,避免气泡产生,静置2min。然后将样品管在磁珠分离器上静置1min,吸去上清液体。④ 重复步骤③一次,最后多吸一次剩余少量上清液体,保证上清液体完全被吸走。⑤ 将样品放置于孔板上,加入10 ul磁珠洗脱液(CE)反复吸打十次以上,吸打过程严格避免气泡。放置5min,使磁珠和洗脱液混悬均匀。⑥ 将样品放置于磁珠分离器上,静置1min ,使磁珠与悬浮液充分分离,将上清液移出到已标记的0.2ml 样品管。⑦取1μl上清液与5μl基质(0.6 g/L)混匀,用0.5μl点靶,每个样品点3个靶点。

1.2.3 尿液多肽谱检测与数据采集

上述样品室温干燥后,放入MALDI—TOF质谱仪进行检测。具体参数设置如下: 选择方法LP-Clinprot. par,靶MTPAnchorchip800/384,N2激光源,激光能量在60% 左右,正离子线性模式和自动采集数据的模式,检测相对分子量范围为1000~ 10000 m/z;

1.2.4 生物信息学软件处理

质谱数据采集后,应用Autoflex analysis 对图谱进行基线的平滑、衰减、标峰及用Excel 表格进行数据输出。质谱数据采集后通过Flex Analysis 3.0(德国Bruker)进行基线的平滑、衰减、标峰及数据输出,其基本功能如下:

调出所有质谱图、基线平滑、基线衰减、选定蛋白质相对分子质量1000~10 000的标峰方法(信噪比大于5)进行自动标峰,将谱图结果用Excel表格输出。

1.2.5 统计学数据处理采用ClinPro Tools 软件进行处理

计量资料用均数± 标准差(x ± s)表示,对疾病组和健康组进行比较采用LSD-t 检验,P < 0.05 为差异有统计学意义。采用SPSS19.0绘制ROC曲线,计算曲线下面积(AUC)以及敏感度和特异度。

2 结果

2.1 MPSⅠ组与正常组尿液多肽谱比较

两组共分析出46个峰,见图1、图2。统计分析后显示7个多肽峰差异均具有统计学意义(P <0.05) ,分子量分别是1069.6、2752.7、2223.8、2374.9、1657.5、5492.9、3217.3,见表1。其中疾病组中高表达的4个,低表达的3个。

图1 疾病组尿液多肽谱图

图2 对照组尿液多肽谱图

表1 MPSⅠ组与正常组差异多肽峰的比较

2.2 ROC曲线

分别绘制分子量为1069.6、2752.7、2223.8、2374.9、1657.5、5492.9、3217.3的多肽诊断MPSⅠ型的ROC曲线(见图3),并计算曲线下面积以及灵敏度和特异度(见表2)。7种多肽诊断MPSⅠ型的AUC分别为0.982、0.893、0.795、0.768、0.786、0.714、0.946;其中分子量为1069.6和3217.3的多肽,具有100%的敏感度和87.5%的特异度。

图3 7种多肽诊断MPSⅠ型的ROC曲线

表2 7种多肽诊断MPSⅠ型的AUC、敏感度和特异度

讨论

粘多糖病Ⅰ型是由于患者体内α-L-艾杜糖苷酶活性降低或失活,导致DS、HS在各组织器官累积,从而致病的一种罕见遗传代谢性疾病。临床表现主要包括智力缺陷、心瓣膜疾病、粗糙面容、肝脾肿大和角膜混浊等。根据病情轻重分为三个亚型,其中症状最严重的称为Hunler综合征,症状较轻的称为Scheieor综合征,介于两者之间的是Hurler/Scheieor综合征[4,5]。粘多糖病患儿出生时一般无明显颜面特征,可能有脐疝和腹股沟疝,病情随着年龄增长而呈进行性加重。如果延误诊断,疾病所造成的机体改变是不可逆的,所以对于该病的早期诊断、早期干预非常必要。

目前针对该粘多糖病的实验室检查包括尿液粘多糖定量和电泳、外周血白细胞α-L-艾杜糖苷酶活性测定和IDUA基因突变检测。尿液粘多糖定量是采用晨尿,经染料染色后发生颜色变化,电泳后可显示硫酸皮肤素和硫酸类肝素条带,但由于多糖不稳定,且染料与多糖的结合特异性不足,所以该法准确性较低,仅用于初筛[6];酶活性检测通常采用荧光免疫法检测外周血白细胞中α-L-艾杜糖苷酶活性,患者酶活性显著低于正常人,该法步骤较繁琐,易受手工操作者的影响;IDUA基因突变检测有助于病因确诊及产前诊断,但该病呈现复杂的分子异质性,给检测带来难度,不便于实验室常规开展。并且现有的检测方法均不能解释“粘多糖在体内累积是如何造成各组织器官功能受损”这一临床亟待解决的问题。同时,由于粘多糖病的致病原因尚未完全明确,所以针对该病的治疗依赖于造血干细胞移植和酶替代治疗。但以上治疗方法均价格昂贵,多数患儿家庭仅能负担对症支持治疗,并不能延缓疾病进程[7]。所以,针对粘多糖致病机制的研究也可以为寻找新的治疗手段提供思路。

蛋白质组研究不仅能为生命活动规律提供物质基础,也能为众多种疾病机理的阐明提供理论根据和解决途径。尿液蛋白约30%来源于血浆蛋白,包含多种生物标志,可以间接反映血浆蛋白的组成[8]。采用尿液作为蛋白质组学的研究对象具有以下优点:首先尿液收集是非侵入性,患者一般都愿意多次提供样品,因此尿液适合监测疾病进展和对治疗的反映;其次尿液中包含的小分子蛋白和多肽不需过多的处理步骤便可直接分析,避免了由蛋白水解所带来的变异性与复杂性,这不仅节省了时间,也降低了实验的变异性;并且尿液是一种稳定的样本,因其储存在膀胱的过程中已被蛋白水解酶水解完全,所以合理冻存后蛋白成分不会发生太大改变[9,10]。因此,利用蛋白质组学技术来检测患者尿液中的各种特异性生物学指标具有较强的可行性与可操作性。

近二十年来,尿液蛋白质组学的研究技术也在不断发展。1979年,Anderson最早采用双向电泳的方法对正常尿液样本中的蛋白进行分析,但是双向电泳低通量,且对疏水蛋白和复杂样本的分析能力有限,这使其现在运用较少。之后发展的液相色谱分离联合质谱技术,具有高效性、高灵敏度和高分辨率的特性,从而倍受青睐。近几年,MALDI-MS技术也广泛应用于尿液蛋白质组学研究,由此得到蛋白质指纹图谱可以检测到几百个峰值信号[11,12]。但传统的双向电泳结合MALDI-TOF MS或者毛细管电泳联用电离飞行时间质谱的方法,操作复杂,限制其应用。磁珠是近年发展起来并在生物医学领域广泛应用的一种新型多功能试剂,同时具有载体和分离功能[13,14],并且磁珠分离结合质谱法尚未应用于黏多糖病患者尿液多肽谱分析,故本研究采用此方法,以期找出差异多肽峰。

由于近几年的研究发现,分子量在1 000 ~ 40 000 d 之间的尿蛋白峰值比较有意义[15,16],所以本研究也主要关注相对分子质量在1000-10000m/z之间的小分子多肽。本研究结果显示,在MPSⅠ型和对照组中,多肽谱出峰主要集中在6500m/z以下分子量较小的区域,共出峰48个。经过数据分析后,具有显著性差异的有7个,其中疾病组中高表达的4个,m/z分别为2223.8、1657.5、5492.9、3217.3,疾病组中低表达的3个,m/z分别为1069.6、2752.7、2374.9。其中分子量为1069.6和3217.3的蛋白,AUC在0.9以上,且具有100%的敏感度和87.5%的特异度。所以两个多肽峰有望作为MPSⅠ型患者的诊断模板,帮助疾病筛查。并且,在进一步的实验中,我们将对差异多肽峰进行种类鉴定,从而寻找疾病的生物标志物,为其早期诊断、预后监测和寻求新的治疗方法提供线索。但由于此病为罕见病,本实验中疾病组例数较少,接下来我们将收集更多的标本,从中进行验证,确定诊断模板的敏感度和特异度。

本研究表明,运用MB-WCX联合MALDI-TOF MS技术,可以有效地检测正常人与MPSⅠ患者的尿液多肽谱,并且寻找在疾病组中存在差异的多肽峰,以作为潜在的生物标志物,为MPSⅠ型的鉴别诊断及疾病机制的探索提供研究依据。

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Analysis of Urinary Polypeptide Pattern of MucopolysaccharidosisⅠby Magnetic Beads based Weak Cation Exchange Separation Technology and Matrix-assisted Laser Desorption-inoization Time of Flight Mass Spectrometry Technology

Xiaozhou Yuan1, Yan Meng2, Shuang Liang1,Wencan Jiang1, Sujun Ge1, Jinyan Duan1, Chengbin Wang1
(1, Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853; 2, Pediatric Department, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853)

ObjectiveTo analyse the urinary polypeptide pattern of mucopolysaccharidosis Ⅰ(MPS Ⅰ)Methods8 patients with MPS Ⅰ(MPS Ⅰ group) and 10 healthy people(healthy control group)were enrolled and detected urinary polypeptide pattern by magnetic beads based weak cation exchange separation(MB-WCX) technology and matrix-assisted laser desorption-inoization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) technology. ClinProtTM software was used to profile and screen the differential polypeptides in urine, and ROC curve were draw, the area under the curve(AUC), contrast sensitivity and specificity were analyzed.ResultFrom 1000 and 10000 Da of relative molecular mass, 7 significant different(P<0.05) polypeptide were detected between MPS Ⅰ group and healthy control goup . Two peptides(m/z:3217.3,1069.6) can be potential biomarker to clarify two groups with a specificity of 87.4%and a sensitivity of 100%.ConclusionMALDI-TOF-MS combined with WCX kit technology is a convenient and high throughput method to selected polypeptide biomarker of MPS Ⅰ, providing a noninvasive new way for screening and diagnosis MPS Ⅰ.

mucopolysaccharidosis Ⅰ; magnetic beads based weak cation exchange; matrix-assisted laser desorption-inoization time of flight mass spectrometry; polypeptide, urine

R392.12

A

10. 11967/ 2017150108

R392.12

ADOI:10. 11967/ 2017150108

国家自然科学基金(No.81601852)。

苑晓舟,1993年生,女,硕士研究生,研究方向:遗传代谢性疾病实验室诊断。Email:yuanxiaozhou123@sina.com.

王成彬,1961年生,男,主任医师,教授,研究方向:感染性炎症发生机制及实验室早期诊断。Email:wangchengbin301301@126.com.段晋燕, 1982年生,女,主管技师,研究方向:临床检验相关方面。Email:cathyduanjinyan@126.com.

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