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建立牛奶中黄曲霉毒素M1含量的超高效液相快速测定法

2017-04-12王安波刘文锋

中国畜牧兽医文摘 2017年3期
关键词:定容黄曲霉乙腈

王安波 孙 思 杨 梅 汪 俭 刘文锋

(黔东南州农产品质量安全检测中心,贵州凯里 556000)

建立牛奶中黄曲霉毒素M1含量的超高效液相快速测定法

王安波 孙 思 杨 梅 汪 俭 刘文锋*

(黔东南州农产品质量安全检测中心,贵州凯里 556000)

基于GB 5413.37-2010优化建立牛奶中黄曲霉毒素M1的测定方法,在GB 5413.37-2010第二法基础上,以样品直接离心除杂,通过免疫亲和柱净化,经25%乙腈-水溶液洗脱定容,用超高效液相色谱仪测定,采用外标法定量。该方法对黄曲霉毒素M1的线性范围为0.5~16.0μg/L,R2=0.9997,最低检测浓度为0.1μg/L,样品中的回收率在77.7%~88.6%,RSD≤5%。该方法能对牛奶中的黄曲霉毒素M1含量进行定性和定量分析,方法精密度、准确度较高,操作快速、简便,结果满意。

超高效液相色谱仪 黄曲霉毒素M1牛奶

1 前言

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)主要由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生,均为二氢呋喃香豆素衍生物[1]。黄曲霉毒素是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素,早在20世纪90年代就已经被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物[2]。

根据《GB 2761-2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》我国乳及乳制品中黄曲霉毒素M1最高限量值为0.5 µg/kg[3]。常用检测方法有免疫亲和法、层析液相色谱法、免疫亲和层析液-质联用法、免疫亲和层析荧光分光度法、双流向酶联免疫法等[4]。本研究在GB 5413.37-2010第二法(免疫亲和层析液相色谱法)的基础上,采用直接离心除杂,免疫亲和柱净化后流动相洗脱定容,用超高效液相色谱测定,外标法定量,建立了生鲜乳中黄曲霉毒素M1的快速测定方法。

2 材料与方法

2.1 试验材料、试剂及仪器

2.1.1 样品:牛奶样品购于当地奶牛养殖场。

2.1.2 药品与试剂:黄曲霉毒素M1(AFM1),标准品含量10µg/ml,Pribolab;黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(VICAM AflaTest WB);Φ11cm中速定性滤纸(新星,中性);乙腈为色谱纯,水为超纯水。

2.1.3 仪器与设备:ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱,waters公司;荧光检测器ACQUITY FLR(带13 µl大体积流通池),waters公司;色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 um),waters公司;高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;超声波清洗器,上海声彦超声波仪器有限公司;固相萃取装置,杭州赛析科技有限公司。

2.2 标准品储备液和工作液配制

标准品储备液:精密移取黄曲霉毒素M1(10µg/ml)1.00 ml置10 ml容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,得黄曲霉毒素M1标准储备液(1µg/ml)。

标准品工作液:精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液(1µg/ ml)1 ml置10 ml容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,作为标准工作液(100µg/L)。

2.3 样品提取与净化

将样品放置至室温(23±3 ℃)下称量30 mL试样,置于聚丙烯离心管中,10000 r/min下离心10 min。上清液经中性滤纸过滤收集至少10 ml滤液为备用液。将黄曲霉免疫亲和柱安装于固相萃取装置上,精密量取10.0 ml备用液自然过柱,用2 ml水洗,真空抽干。用2 ml乙腈(25%)-水溶液洗脱,收集洗脱液,过0.22µm有机相微孔滤膜后上机分析。

2.4 液相色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7µm),柱温30℃;流动相为乙腈-水(25:75),等度洗脱,流速0.20 ml/min;进样量2µl,保留时间3.90±0.15min,运行时间12 min;荧光检测器-大体积流通池;激发波长365 nm、发射波长429 nm。根据仪器特性及实际情况,优化了流速及进样量。

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

将2.2中标准工作液精密量取相应体积,用流动相乙腈(25%)-水溶液定容至2 ml,配成浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 µg/L的系列标准溶液,涡旋混匀,过0.22 µm滤膜,供液相色谱分析。按照外标法计算得到曲线方程,Y=112919X-12833,R2=0.9997。结果如图1所示,黄曲霉毒素M1浓度在0.5~16.0 µg/L之间呈线性关系,满足含量测定要求。

图1 黄曲霉毒素M1标准曲线

3.2 准确度和精密度试验

采用标准添加法,取牛奶空白样品基质30.0 ml各3份,分别添加3个不同浓度的黄曲霉毒素M1标准品,按照2.3项下的方法进行操作,用外标法做添加回收试验.

牛奶空白基质样品在0.1、0.5、2.0 µg/L 3个不同浓度的黄曲霉毒素M1进行添加回收加标试验,回收率在77.7%~88.6%之间,RSD≤5%。参考《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》附录F,本方法允许回收率范围为60%~120%、相对标准偏差≤30%,说明该方法对牛奶中黄曲霉毒素M1含量的测定均有良好的准确度和精密度。

3.3 检出限

根据黄曲霉毒素M1限量要求,对本方法条件进行低浓度试验,当标准品浓度为0.1µg/L时,如图2A所示,信噪比S/N>3,表明黄曲霉毒素M1的检出限为0.1µg/L;对牛奶进行加标回收试验,当添加浓度为0.1µg/L时,试验结果如图2B所示,其信噪比S/ N>10,可以确定该方法的最低定量限为0.1µg/L,满足乳及乳制品限量0.5µg/L要求。

图2 0.1μg/kg黄曲霉M1液相色谱图

3.4 样品测定

对所抽的100份牛奶样品进行黄曲霉毒素M1含量检测,检测结果均为未检出。

4 讨论

4.1 前处理方法优化

在配制黄曲霉毒素M1储备液时,GB 5413.37第二法中采用三氯甲烷进行稀释。因考虑到三氯甲烷毒性极高且采购不便,本方法直接选择购买液体标准品,乙腈进行稀释定容,效果良好。

GB 5413.37第二法中采用50 ml滤液过柱,经10 ml水洗后用4 ml乙腈洗脱并氮吹至50~500µl,用水10倍定容。在实际操作过程中,氮吹后剩余量难以精确计量,因此造成实验误差较大,且操作烦琐。本方法采用10 ml滤液过柱,2 ml水洗真空抽干,直接用乙腈(25%)-水溶液洗脱定容,操作简便且利于控制。

4.2 上机检测条件优化

本试验回收率的关键在于黄曲霉免疫亲和柱,因此在每批次试验之前都要进行柱效验证。本试验过程中对比了三种黄曲霉免疫亲和柱,其中两种免疫亲和柱柱效仅为61%~68%,难以满足定量检测要求。而本试验选用的Waters公司黄曲霉免疫亲和柱经多次试验,柱效均在90%以上,RSD≤5%,效果良好。

5 结论

本试验是基于GB 5413.37第二法,以样品直接离心除杂通过免疫亲和柱净化,经25%乙腈-水溶液洗脱定容,用超高效液相色谱仪测定,采用外标法定量。研究表明,该方法能对牛奶中的黄曲霉毒素M1进行定性和定量分析,方法精密度、准确度较高,操作快速、简便,结果满意。

[1] El Khoury A, Atoui A, Yaghi J. Analysis of aflatoxin M1 in milk and yogurt and AFM1 reduction by lactic bacteria used in Lebanese industry [J]. FoodControl,2011,22(10):1695-1699.

[2] Ren Y P, Zhang Y, Shao S L, et al. Simultaneous determination of multi component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2007, 1143(1-2): 48-64.

[3] GB2761-2011.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量. GB2761-2011.National food safety standard Limit level of mycotoxins in food (in Chinese).

[4] GB 5413.37-2010.食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定. GB 5413.37-2010. National food safety standard Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products.

王安波(1991-),男,助理兽医师,从事农产品质量安全检测工作。

刘文锋(1969-),男,农业推广研究员,从事农产品质量安全检测工作。

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