Caveolin-1和紧密连接蛋白在小鼠血吸虫性结肠炎中的表达及其意义*

张 林 李 瑾 林 雪 肖 军

武汉大学中南医院消化内科/湖北省肠病医学临床研究中心 肠病湖北省重点实验室(430071)

Caveolin-1和紧密连接蛋白在小鼠血吸虫性结肠炎中的表达及其意义*

张 林#李 瑾 林 雪 肖 军△

武汉大学中南医院消化内科/湖北省肠病医学临床研究中心 肠病湖北省重点实验室(430071)

背景：血吸虫肠病是一种血管内寄生虫病，结肠慢性炎症是其基本的病理改变之一。目前有关caveolin-1和紧密连接蛋白参与血吸虫肠病发病的机制仍不明确。目的：初步探讨caveolin-1和紧密连接蛋白occludin、claudin-1在小鼠血吸虫性结肠炎中的表达及其意义。方法：将40只BALB/c雄性小鼠随机分成正常对照组和感染组。小鼠腹部贴片感染约40条日本血吸虫尾蚴建立血吸虫性结肠炎模型。8周后处死小鼠，行HE染色，伊文思蓝法检测肠道血管内皮细胞通透性，计数腹腔灌洗液中的白细胞，qPCR法检测结肠组织中caveolin-1、occludin、claudin-1、eNOS mRNA表达，蛋白质印迹法和免疫组化检测caveolin-1和occludin蛋白表达。结果：感染组结肠黏膜下层可见大量虫卵肉芽肿，并伴有肠壁广泛的炎症细胞浸润。与正常对照组相比，感染组腹腔灌洗液中伊文思蓝含量和白细胞计数均显著升高(P<0.05)，caveolin-1、occludin、claudin-1 mRNA表达显著降低(P<0.01)，caveolin-1、occludin蛋白表达和阳性率均显著降低(P<0.05)。结论：Caveolin-1、occludin和claudin-1表达下调可能通过影响肠道血管内皮细胞的通透性，诱发白细胞聚集，从而参与血吸虫性结肠炎的发病。

血吸虫病； 结肠炎； 窖蛋白1； 紧密连接蛋白

血吸虫肠病是我国长江中下游地区常见的寄生虫病[1]。肠道血管内皮细胞受损在血吸虫肠病发病中起重要作用[2]，内皮细胞受损可影响白细胞与血管内皮细胞的黏附，改变血管通透性，加重肠道炎症。紧密连接是肠道血管内皮细胞中的重要物理屏障结构，对维持微血管通透性具有重要意义。Caveolin-1是小窝蛋白家族成员之一，研究[3-5]表明，caveolin-1通过影响内皮细胞间紧密连接而调控血管通透性。本研究通过建立血吸虫性结肠炎小鼠模型，检测caveolin-1和紧密连接蛋白表达，初步探讨其与血管通透性改变进而诱发白细胞聚集之间的联系，旨在进一步认识血吸虫肠病的发病机制，为患者的个体化治疗提供一定的理论基础。

材料与方法

一、实验动物、主要试剂

1. 实验动物和血吸虫虫种：选取健康2～4周龄SPF级BALB/c雄性小鼠40只，由武汉大学动物实验中心提供。感染用日本血吸虫尾蚴阳性钉螺购自湖北省疾病预防控制中心血吸虫病防治研究所，实验室人工培养。

2. 主要试剂：伊文思蓝(Sigma公司)，Trizol(北京艾德莱生物科技有限公司)，逆转录试剂盒(GeneCopoeia Inc.)，实时PCR试剂盒(TAKARA公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗caveolin-1(Abcam公司)，兔抗GAPDH和兔抗occludin(武汉三鹰生物技术有限公司)；HRP标记的羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；瑞氏染液(南京建成生物工程研究所)。

二、实验方法

1. 造模和分组：将小鼠随机分为感染组和正常对照组，每组各20只。感染组常规腹部贴片感染约40条日本血吸虫尾蚴，建立血吸虫性结肠炎小鼠模型。正常对照组不接种尾蚴，常规喂养。感染后8周观察实验指标的变化，同时解剖取结肠标本。

2. 肠道血管通透性和白细胞穿透性的检测[5]：小鼠尾静脉注射1%的伊文思蓝40 mg/kg，3 h后处死。处死前腹腔注射5 mL无菌PBS，充分灌洗小鼠腹腔，回收腹腔液体(>4 mL)，350×g离心10 min。取上清液200 μL，以分光光度计测定620 nm波长处的吸光度(A)值，通过检测灌洗液中伊文思蓝含量反映血管通透性。同时将离心后的沉淀以1 mL PBS重悬，乙酸和结晶紫染色，计数白细胞。

3. qPCR法检测肠道组织mRNA表达：取小鼠结肠组织约100 mg，Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，行PCR反应。Caveolin-1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、occludin、claudin-1、GAPDH的引物序列见表1。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 10 min。目的基因的mRNA表达以2-△△Ct进行计算，反应均设3个复孔。

4. 蛋白质印迹法检测肠道组织蛋白表达：取约100 mg肠道组织，加入裂解液裂解，BCA法检测蛋白浓度。取40 μg总蛋白行12%SDS-PAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入caveolin-1、occludin和GAPDH一抗(工作浓度分别为1∶20 000、1∶1 000、1∶1 000)孵育过夜。TBST洗涤后加入HRP标记的二抗，孵育2 h。ECL化学发光试剂自显影，凝胶成像系统采集并分析，各蛋白的表达以目的蛋白与内参灰度值的比值表示。

5. 免疫组化染色：小鼠结肠组织固定后常规脱水，石蜡包埋，切片厚4 μm，行HE染色。连续切片后脱蜡，乙醇梯度水化，微波加热修复抗原。加入caveolin-1和occludin(工作浓度分别为1∶100、1∶50)和二抗，DAB显色，自来水冲洗终止反应，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。高倍镜下随机选取4～5个视野，采用半定量积分法，总分为阳性细胞率和阳性细胞着色强度之积。染色强度：无染色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞率：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。总分0～1分为阴性，2～4分为阳性，>5分为强阳性。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况和结肠病理改变

感染后8周处死小鼠，以眼科镊挑取肠系膜血管中的成虫(图1)。大体观察示正常对照组小鼠肠黏膜基本正常；感染组小鼠肠道变粗，肠黏膜充血水肿，可见糜烂坏死，病变以结肠为主。HE染色示感染组小鼠结肠黏膜下层可见大量虫卵肉芽肿(图2A)，并伴有肠壁广泛的炎症细胞浸润，部分表浅上皮脱落坏死；正常对照组小鼠结肠组织结构完好，仅可见少量散在的炎症细胞浸润，未见到虫卵肉芽肿(图2B)。说明血吸虫性结肠炎造模成功。

图1 镜下血吸虫成虫(×200)

A：感染组；B：正常对照组

图2 小鼠结肠组织HE染色(红色箭头所示处为虫卵肉芽肿)(×200)

二、肠道血管通透性改变

感染组小鼠腹腔灌洗液中伊文思蓝含量显著高于正常对照组(P<0.05)(表2)，表明血吸虫感染后肠道血管通透性增强。

三、腹腔灌洗液白细胞计数

感染组腹腔灌洗液中白细胞计数明显高于正常对照组(P<0.01)(表2)，说明血吸虫感染可增强白细胞穿透肠道微血管的能力。

四、mRNA表达

与正常对照组相比，感染组caveolin-1、occludin、claudin-1 mRNA表达均显著降低(P<0.01)，eNOS mRNA表达无明显差异(P=0.126)(图3)。

五、蛋白表达

与正常对照组相比，感染组小鼠caveolin-1和occludin蛋白表达显著降低(P<0.01)(图4)。

表1 引物序列和产物长度

组 别例数A620nm白细胞计数(×106/L)正常对照组200．19±0．424．45±1．06感染组200．39±0．64∗20．45±1．77∗∗

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

*与正常对照组比较，P<0.01

六、免疫组化结果

正常对照组小鼠结肠黏膜组织中caveolin-1和occludin蛋白阳性着色主要定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色或棕褐色；感染组小鼠结肠黏膜组织中棕黄色信号明显减弱，阳性细胞数明显减少，分布不均匀(图5)。与正常对照组相比，感染组caveolin-1和occludin的阳性率均显著降低(χ2=6.144，P=0.013；χ2=11.905，P=0.001)(表3)。

*与正常对照组比较，P<0.01

图4 两组小鼠结肠组织caveolin-1和occludin蛋白表达(蛋白质印迹法)

A：正常对照组caveolin-1；B；感染组caveolin-1；C：正常对照组occludin；D：感染组occludin

图5 caveolin-1和occludin在小鼠结肠组织中的表达(免疫组化染色，×400)

表3 两组小鼠caveolin-1和occludin的阳性率比较 n (%)

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

讨 论

血吸虫在人接触疫水后，主要寄生于门静脉和肠系膜下静脉，因此病变主要位于直肠、乙状结肠和降结肠。虫卵沉积在肠黏膜和黏膜下层可引起微血管阻塞，同时诱发白细胞聚集，进而特异性地攻击血吸虫卵，引起炎症反应，导致糜烂、溃疡等。随着病程进展炎症刺激可致纤维组织增生，引起肠壁增厚，导致息肉和狭窄，严重时可形成肠梗阻。以往对血吸虫病的研究多集中于血吸虫肝纤维化领域，而对血吸虫肠道病变的分子机制鲜有报道。血吸虫肠病的临床表现缺乏特异性，易与炎症性肠病(IBD)、肠结核等混淆，误诊、漏诊率高，且与肿瘤发生有一定相关性。肠黏膜活检是诊断血吸虫肠病的金标准，但血吸虫虫卵的沉积部位可能较深，内镜活检不一定可发现血吸虫虫卵，血吸虫肠病内镜诊断率仅20.2%～35.7%[6]。因此加强对血吸虫肠病分子机制的阐述，寻找特异性血液标记物，对血吸虫肠病患者具有重要意义。

本研究中，给予小鼠腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴后，黏膜和黏膜下层可见大量虫卵肉芽肿，并伴有广泛的炎症细胞浸润，证实血吸虫性结肠炎造模成功。感染组腹腔灌洗液中伊文思蓝含量和白细胞计数均明显高于正常对照组。说明血吸虫感染后血管通透性增加，白细胞穿透血管的能力增强，进而诱发白细胞聚集，可能共同参与了血吸虫肠病的发病过程。

小窝蛋白基因家族成员目前包括caveolin-1、caveolin-2和caveolin-3[7]。Caveolin-1广泛分布表达于脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞中，参与细胞转运(跨细胞和细胞旁途径)、胆固醇运输、血管生成等多种生理过程，并与肿瘤生成、病原体感染关系密切[8]。Caveolin-1还可调控血管通透性，已有研究[5,9]表明，在血脑屏障中caveolin-1可通过调节紧密连接蛋白水平维持血管内皮细胞的稳定性；Xu等[10]的研究发现，caveolin-1表达降低可下调紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-4的表达，可能是导致肺上皮屏障受损，进而引起肺支气管发育不良的主要机制。本研究发现，感染组小鼠caveolin-1 mRNA和蛋白表达均较正常对照组显著降低。由此可见，血吸虫感染通过调控caveolin-1表达影响肠道微血管的紧密连接，进而调控血管渗透性，诱发白细胞聚集，这种长期反复的慢性炎症可导致肠黏膜增生，最终导致肠纤维化。

紧密连接主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连接复合体中，对维持血管内皮细胞稳定性和肠黏膜屏障具有重要作用[11]。在急性肺损伤模型中，炎症介质介导的紧密连接蛋白下调，不仅导致肺泡上皮屏障受损，还可加重毛细血管内皮细胞的损伤，导致肺水肿进一步加重[12]。occludin和claudin-1是紧密连接的主要功能蛋白之一。本研究发现，感染组occludin和claudin-1 mRNA表达较正常对照组显著降低，claudin-1蛋白表达明显降低。说明血吸虫性结肠炎中caveolin-1表达下调，可能直接或间接影响occludin、claudin-1表达，调控血管内皮细胞通透性。未来可通过构建过表达或沉默caveolin-1的质粒，进一步证实其与紧密连接蛋白之间的关系。

紧密连接蛋白还是构成肠上皮屏障的主要结构基础，其表达下调可影响肠屏障功能，导致肠道内细菌、抗原易位，加重黏膜免疫的异常反应，为IBD的主要发病机制之一[11,13]。因此，血吸虫性结肠炎中occludin和claudin-1表达下调可能通过影响肠屏障功能，导致毒素入血，激活炎症因子，进一步加重肠黏膜炎症细胞浸润，但该结论有待研究进一步证实。此外，caveolin-1为eNOS的负性调节因子，caveolin-1基因敲除的小鼠体内血管通透性增高，可能与eNOS活性上调、NO产生增多有关[3-4]。本研究结果显示感染组和正常对照组eNOS mRNA表达无明显差异。推测caveolin-1对eNOS仅起“活性开关”的作用，其下调会激活eNOS，但对于eNOS基因表达并无影响[4]。

综上所述，血吸虫性结肠炎小鼠中caveolin-1和紧密连接蛋白occludin、claudin-1表达均显著下调，可能通过影响肠道血管内皮细胞的通透性，诱发白细胞聚集，从而参与血吸虫肠病的发病。这种长期反复的慢性炎症刺激，可导致肠黏膜增生，最终导致肠纤维化的发生。但血吸虫肠病的发病机制复杂，并非仅受单一基因调控和单一因素影响。此外，caveolin-1与紧密连接蛋白之间的关系及其调控机制还有待进一步研究证实。

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13 Mankertz J, Schulzke JD. Altered permeability in inflammatory bowel disease: pathophysiology and clinical implications[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2007, 23 (4): 379-383.

(2016-10-17收稿)

Expressions and Significances of Caveolin-1 and Tight Junction Proteins in Schistosomiasis Colitis in Mice

ZHANGLin,LIJin,LINXue,XIAOJun.

DepartmentofGastroenterology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,HubeiClinicalCenter&KeyLabofIntestinal&ColorectalDiseases,Wuhan(430071)

XIAO Jun, Email: xiaojunzhongnan@163.com

Schistosomiasis; Colitis; Caveolin 1; Tight Junction Proteins

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.03.005

湖北省自然科学基金科技计划项目(2015CKB742)

#Email: zhanglin19910528@163.com

△本文通信作者，Email: xiaojunzhongnan@163.com

Background: Intestinal schistosomiasis is a kind of intravascular parasitic diseases, and chronic inflammation of colon is one of the basic pathological changes of the sickness. However, the mechanism of caveolin-1 and tight junction proteins in the pathogenesis of intestinal schistosomiasis is still unclear. Aims: To study the expressions and significances of caveolin-1 and tight junction protein occludin, claudin-1 in schistosomiasis colitis in mice. Methods: Forty BALB/c male mice were randomly divided into control group and infection group. Schistosomiasis colitis model was established by placing 40SchistosomaJaponicumcercarieon the abdomen. Mice were sacrificed after 8 weeks. HE staining was performed. The permeability of intestinal vascular endothelium was detected by Evans blue method. The leukocyte counts in peritoneal lavage fluid were measured. qPCR was used to determine the mRNA expressions of caveolin-1, occludin, claudin-1 and eNOS in colon tissue. Western blotting and immunohistochemistry were used to detect the protein expressions of caveolin-1 and occludin. Results: Large number of egg granuloma was observed in colon submucosa and accompanied by extensive inflammatory cells infiltration in infection group. Compared with control group, content of Evans blue and leukocyte counts in peritoneal lavage fluid were significantly increased (P<0.05); mRNA expressions of caveolin-1, occludin, claudin-1 were significantly decreased (P<0.01); protein expressions and positivity rates of caveolin-1 and occludin were significantly decreased in infection group (P<0.05). Conclusions: Down-regulation of expressions of caveolin-1, occludin and claudin-1 can induce leukocyte accumulation via increasing the permeability of intestinal vascular endothelial cells, thereby involving in the development of schistosomiasis colitis.