siRNA沉默Ran基因对结肠癌细胞株凋亡和Caspase-3、PARP表达的影响*

汪 鑫 耿 蕾 孙丽娜 孙利慧 卢瑗瑗 王 新

第四军医大学西京消化病医院 肿瘤生物学国家重点实验室(710032)

·论 著·

siRNA沉默Ran基因对结肠癌细胞株凋亡和Caspase-3、PARP表达的影响*

汪 鑫 耿 蕾 孙丽娜 孙利慧 卢瑗瑗 王 新

第四军医大学西京消化病医院 肿瘤生物学国家重点实验室(710032)

背景：结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一。本课题组前期研究发现结肠癌特异性抗原类硫氧还蛋白-2(Txl-2)的亚型之一Txl-2b可与Ras相关核蛋白(Ran)相互作用，但Ran在结肠癌发病过程中的作用和机制鲜有报道。目的：以RNA干扰技术靶向沉默结肠癌细胞株Ran基因，观察该方法对细胞凋亡和半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)表达的影响。方法：设置si-1、si-2、si-3以及阴性对照(NC)组，分别将终浓度为20、40、60 nmol/L的Ran小干扰RNA(siRNA)-1、siRNA-2、siRNA-3以及NC siRNA转染结肠癌细胞株HCT116、DLD-1。采用蛋白质印迹法检测siRNA干扰效率以及caspase-3、PARP表达的变化；采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：20 nmol/L siRNA-1、siRNA-2抑制Ran表达的效果最佳。si-1组HCT116、DLD-1细胞的早期凋亡率较NC组显著增加(19.37%±7.57%对4.83%±1.72%；16.53%±3.38%对6.27%±3.13%；P均<0.05)。si-1组、si-2组HCT116、DLD-1细胞的晚期凋亡率较NC组显著增加(15.97%±3.31%、16.33%±5.40%对 6.40%±1.05%；22.93%±1.57%、11.50%±0.70%对6.20%±0.98%；P均<0.05)。si-1组、si-2组DLD-1细胞与NC组相比，被切割的caspase-3(活性形式)和被切割的PARP(非活性形式)表达水平显著升高。结论：沉默Ran基因能明显促进结肠癌细胞凋亡，其机制与调控caspase-3、PARP表达有关。

结肠肿瘤； Ras相关核蛋白； RNA，小分子干扰； 细胞凋亡； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3； 聚ADP核糖聚合酶类

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病机制尚未完全明确。本课题组前期研究[1]采用分离自结肠癌转移淋巴结的癌细胞免疫BALB/c小鼠，以淋巴细胞杂交瘤技术制备了一组抗结肠癌单克隆抗体，命名为结肠癌单克隆抗体(monoclonal antibodies, MCs)系列。其中，MC3所识别的抗原MC3-Ag在结肠癌组织中的阳性率达90%以上[2]，且表达水平与结肠癌TNM分期、肿瘤转移密切相关[3]。其后本课题组进一步采用蛋白质组学研究方法鉴定并验证了MC3-Ag为硫氧还蛋白家族新成员类硫氧还蛋白-2(thioredoxin like-2, Txl-2)[4]。Txl-2b是 Txl-2的一种亚型[5]，酵母双杂交和免疫共沉淀实验结果表明，Txl-2b可与Ras相关核蛋白(Ras-related nuclear protein, Ran)相互作用[6]。Ran为Ras超家族成员，是细胞中含量最丰富的小G蛋白，相对分子质量为25 kDa(1 Da=0.992 1 u)。Ran具有两种形式，即GDP状态下的非活性形式和GTP状态下的活性形式[7]。Ran在生物体基本生理过程中发挥重要作用，如在分裂间期调节大分子物质的核质转运[8]、在分裂前期促进纺锤体形成、在分裂末期参与核膜再组装[9]等。近年研究指出，Ran在诸多恶性肿瘤中呈高表达，包括结直肠癌[10]、胰腺癌[11]、胃癌[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]、神经母细胞瘤[15]、非小细胞肺癌[16]等，且与肿瘤的恶性表型和不良预后密切相关，可促进肿瘤细胞增殖[11]、侵袭和转移[17]，抑制肿瘤细胞凋亡[13]等。然而，目前尚无研究证实Ran是否影响结肠癌细胞凋亡。本研究通过合成Ran特异性小干扰RNA(siRNA)抑制结肠癌细胞Ran表达，旨在探讨Ran对结肠癌细胞凋亡的影响。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

结肠癌细胞株HCT116、DLD-1(ATCC细胞库)。DMEM培养基、0.25% EDTA-胰蛋白酶、胎牛血清、Opti-MEMTM无血清培养基(Gibco公司)；DharmaFECTTM1转染试剂(GE Healthcare公司)；siRNA寡核苷酸(上海吉玛制药技术有限公司)；RIPA细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)；Ran单克隆抗体、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences公司)；半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、GAPDH单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；β-actin单克隆抗体(Sigma公司)；山羊抗鼠、抗兔HRP标记IgG抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

二、方法

1. 细胞培养：HCT116、DLD-1细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。

2. siRNA转染：取对数生长期HCT116、DLD-1细胞接种至6孔板，以含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基培养。第2 d待细胞贴壁且密度达到30%时，每孔更换为1 600 μL Opti-MEMTM无血清培养基。设置si-1、si-2、si-3以及阴性对照(NC)组，分别将终浓度为20、40、60 nmol/L的三种不同序列片段的Ran siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)以及NC siRNA(表1)与200 μL Opti-MEMTM无血清培养基混合。将5 μL DharmaFECTTM1转染试剂与200 μL Opti-MEMTM无血清培养基混合，室温孵育5 min。将稀释后的siRNA与稀释后的DharmaFECTTM1转染试剂混合，室温孵育20 min。每孔加入400 μL siRNA与DharmaFECTTM1转染试剂混合液混匀，24 h后更换为完全培养基，72 h后收集细胞进行后续实验。

表1 3种Ran siRNA和NC siRNA序列信息

3. 蛋白质印迹法检测siRNA干扰效率：收集细胞，提取总蛋白行蛋白定量，变性，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，非特异封闭，加入Ran单克隆抗体(滴度 1∶2 000)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(滴度 1∶4 000)，室温孵育，ECL显影，灰度分析，筛选最佳siRNA干扰序列。实验重复3次。

4. 流式细胞仪检测细胞凋亡：将筛选出的siRNA序列按优化浓度再次转染HCT116、DLD-1细胞(实验步骤同前)，72 h后离心消化，PBS清洗2遍，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，操作步骤参照试剂盒说明书。实验重复3次。

5. 蛋白质印迹法检测caspase-3、PARP表达变化：将筛选出的siRNA序列按优化浓度再次转染DLD-1细胞(实验步骤同前)，72 h后离心消化，收集细胞提取总蛋白，以蛋白质印迹法检测caspase-3、PARP表达(实验步骤同前)。

三、统计学分析

结 果

一、Ran siRNA对HCT116、DLD-1细胞Ran表达的抑制效率

siRNA转染HCT116、DLD-1细胞后，20、40、60 nmol/L si-1、si-2、si-3组的Ran蛋白表达水平均显著低于NC组(P<0.05 )，其中以20 nmol/L si-1、si-2组的抑制效果最佳，抑制率均>50%，显著高于其他浓度组以及si-3组(P均<0.01)(图1、图2)。故选择20 nmol/L siRNA-1、siRNA-2进行后续实验。

二、Ran siRNA对HCT116、DLD-1细胞凋亡的影响

NC组、si-1组、si-2组HCT116细胞早期凋亡率分 别为4.83%±1.72%、19.37%±7.57%和 21.10%±13.46%，si-1组早期凋亡率较NC组显著增加(P<0.05)；三组晚期凋亡率分别为6.40%±1.05%、15.97%±3.31%和16.33%±5.40%，si-1组、si-2组晚期凋亡率均较NC组显著增加(P<0.05)(图3)。

NC组、si-1组、si-2组DLD-1细胞早期凋亡率分别为6.27%±3.13%、16.53%±3.38%和10.57%±0.85%，si-1组早期凋亡率较NC组显著增加(P<0.05)；三组晚期凋亡率分别为6.20%±0.98%、22.93%±1.57%和11.50%±0.70%，si-1组、si-2组晚期凋亡率均较NC组显著增加(P<0.01)(图4)。

三、Ran siRNA对DLD-1细胞caspase-3、PARP表达的影响

si-1组、si-2组DLD-1细胞与NC组相比，未被切割的caspase-3(非活性形式，位于35 kDa处)表达无明显变化，被切割的caspase-3(活性形式， 位于17 kDa和19 kDa处)表达水平显著升高。si-1组、si-2组DLD-1细胞与NC组相比，未被切割的PARP(活性形式，位于116 kDa处)表达有所下降，被切割的PARP(非活性形式，位于89 kDa处)表达水平显著升高(图5)。

*P<0.05, **P<0.01

*P<0.05, **P<0.01

*P<0.05, **P<0.01

*P<0.05, **P<0.01，***P<0.001

图5 Ran siRNA对DLD-1细胞caspase-3、PARP蛋白表达 的影响(蛋白质印迹法)

讨 论

细胞凋亡涉及一系列基因的激活和表达调控。Caspases家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活和异常表达均可引起细胞凋亡。Caspases家族成员按其在凋亡中发挥的作用可分为启动型、效应型和炎症型三种类型。Caspase-3属于效应型，正常情况下，胞质中的caspase-3以无活性的酶原形式存在，当细胞发生凋亡时，caspase-3被启动型caspases切割成小片段，成为有活性的caspase-3，进而剪切细胞骨架蛋白和核蛋白，如PARP、DNA裂解因子(DNA fragmentation factor, DFF)、核纤层蛋白A(lamin A)等。PARP属于DNA修复酶，与DNA修复、基因完整性有关，是caspase-3最主要的切割底物。细胞凋亡发生时，PARP被剪切成小片段，不能发挥正常功能，导致DNA裂解，细胞凋亡[18]。本研究结果表明，以siRNA抑制Ran表达后，结肠癌细胞株HCT116、DLD-1细胞凋亡明显增多；进一步的研究发现，细胞中被切割的caspase-3和被切割的PARP表达水平均显著升高，提示抑制Ran表达可通过诱导caspase-3活化和PARP失活促进结肠癌细胞发生凋亡。

目前关于下调Ran引起细胞凋亡的机制尚未明确，相关研究数量有限。Yuen等[13]的研究发现，快速生长的肿瘤细胞在Ran下调后更易发生凋亡，可能与PI3K/Akt/mTORC1、Ras/MEK/ERK通路激活有关。Ran下调可影响细胞的核质转运过程，导致转录因子核质定位异常，进而影响特定基因的转录和表达，最终导致肿瘤细胞恶性表型发生。Schnepp等[15]的研究表明，LIN28B可作为Ran mRNA的结合蛋白促进Ran转录和翻译，进而引起肿瘤细胞功能改变。此外，Guvenc等[19]的研究发现，Ran对细胞凋亡的调控机制与存活素(survivin)表达下调有关，survivin 表达下调可导致凋亡抑制蛋白表达下调，促进caspase-3激活，从而引起细胞凋亡。

综上所述，本研究结果显示，沉默Ran基因可通过诱导caspase-3活化和PARP失活促进结肠癌细胞发生凋亡。这一发现为临床治疗结肠癌提供了新思路，但下调Ran引起肿瘤细胞凋亡的调控机制仍需进一步研究。

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(2016-11-08收稿；2016-12-14修回)

Effect of Silencing Ran Gene by siRNA on Apoptosis and Expressions of Caspase-3 and PARP in Colon Cancer Cell Lines

WANGXin,GENGLei,SUNLina,SUNLihui,LUYuanyuan,WANGXin.

XijingHospitalofDigestiveDiseases&StateKeyLaboratoryofCancerBiology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian(710032)

Background: Colon cancer is one of the common malignant tumors of digestive system. In our previous study, it has been demonstrated that colon cancer specific antigen thioredoxin like-2b (Txl-2b) can interact with Ras-related nuclear protein (Ran). However, there are few reports about the role and mechanism of Ran in tumorigenesis of colon cancer. Aims: To investigate the effect of Ran-targeting RNA interference on apoptosis and expressions of caspase-3 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in colon cancer cell lines.Methods: 20, 40 and 60 nmol/L siRNA-1 (si-1 group), siRNA-2 (si-2 group), siRNA-3 (si-3 group) targeting to Ran gene and normal control siRNA (NC group) were transfected into colon cancer cell line HCT116 and DLD-1, respectively. The interference efficiency of siRNAs and expressions of caspase-3 and PARP were detected by Western blotting. Cell apoptosis was determined by flow cytometry. Results: 20 nmol/L siRNA-1 and siRNA-2 had the best effect on inhibiting expression of Ran. Early apoptosis rates of HCT116 and DLD-1 cells in si-1 group were significantly higher than those in NC group (19.37%±7.57%vs. 4.83%±1.72%; 16.53%±3.38%vs. 6.27%±3.13%;Pall <0.05). Late apoptosis rates of HCT116 and DLD-1 cells in si-1 and si-2 groups were significantly higher than those in NC group (15.97%±3.31%, 16.33%±5.40%vs. 6.40%±1.05%; 22.93%±1.57%, 11.50%±0.70%vs. 6.20%±0.98%;Pall <0.05). Compared with NC group, expressions of cleaved caspase-3 (active form) and cleaved PARP (inactive form) were significantly increased in DLD-1 cells of si-1 and si-2 groups. Conclusions: Silencing Ran gene can significantly promote the apoptosis of colon cancer cells, and its mechanism is related to the regulation of caspase-3 and PARP expression.

Colonic Neoplasms; Ras-Related Nuclear Protein; RNA, Small Interfering; Apoptosis; Caspase 3; Poly(ADP-ribose) Polymerases

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.03.003

国家自然科学基金(81272650、81472701、81572929)