ML-超微量磁珠法和Chelex-100法提取脱落细胞的比较研究

王珂，苏晓伟，潘澄，唐柯，李兴业，彭诚，姚雪，尚雷鹏

（北京市公安局海淀分局刑侦支队，北京 100142）

ML-超微量磁珠法和Chelex-100法提取脱落细胞的比较研究

王珂，苏晓伟，潘澄，唐柯，李兴业，彭诚，姚雪，尚雷鹏

（北京市公安局海淀分局刑侦支队，北京 100142）

目的对ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）和Chelex-100法提取脱落细胞DNA的检验效果进行比较，为优化案件里脱落细胞检材的提取方法提供方向。方法对同一份检材（纺织品或作案工具）利用两种提取方法进行DNA的平行提取，常规STR检测，经卡方检验比较差异。结果112份纺织品检材中ML-超微量磁珠法检出率为58.0%，Chelex-100检出率则为45.5%，差异具有统计学意义（χ2＝7.00，P＜0.05）。130份作案工具检材中ML-超微量磁珠法检出率为41.5%，Chelex-100检出率则为33.8%，差异具有统计学意义（χ2＝4.55，P＝0.03）。结论ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）提取脱落细胞更具有优势。

法医遗传学；超微量磁珠法（KingFisher Flex）；Chelex-100；STR检验；脱落细胞

脱落细胞的检验是法医DNA检验的热点和难点之一，脱落细胞检材包括口腔脱落细胞检材、体表脱落细胞检材、人体排泄物和分泌物等。对于这些潜在的微量物证，一旦成功获得了DNA分型结果，往往为案件侦破提供了方向，并为案件定性和法庭量刑提供科学依据[1]。因此，如何从微量脱落细胞检材中提取足够的DNA以满足法医学检验的需要，选择合适的提取方法显得尤其重要。本文以纺织用品（主要为衣物）和作案工具（刀柄、老虎钳）为研究对象，分别用ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）和Chelex-100法对脱落细胞进行提取，采用平行比对的方法，以比较检出差异。

1 材料与方法

1.1 材料

KingFisher专用磁珠DNA提取试剂盒；Chelex-100悬浮液，脱落细胞粘取器，DNA提取专用棉签（上海博坤信息技术有限公司）

本文分析的112份纺织品和130份作案工具类检材均来自实验室日常收检。每个纺织品检材使用脱落细胞粘取器平行提取两份，作案工具使用DNA专用提取棉签平行提取两份，进行常规STR检测。

1.2 方法

1.2.1 Chelex-100法

剪取适量检材，放置于1.5m L离心管中，加入5%的Chelex-100悬浮液60 uL，放置于56℃保温30min，震荡，再放置于100℃煮沸8min，13000 r/min离心3min。

1.2.2 ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）

剪取适量检材，放入1.5mL离心管中，加入300uL消化液与PK的混合液（按照12.5∶1的比例向消化液ML中加入10mg/mL的蛋白酶K）；56℃温浴1 h，消化后，将离心管放入离心机中，13000 r/min离心3min，使载体与消化产物完全分离；将试剂盒中2号板打开，将消化产物转移到试剂板中；将1号板和塑料磁套外包装打开，轻微颠倒1号板几次，将磁珠悬浮到溶液中，并将溶液甩至孔底后，撕去密封塑料膜，将塑料磁套放置于1号板中；将洗脱板外包装打开，用8道排枪向洗脱板孔内加40 uL高纯水；将3、4、5号板外包装打开，撕掉密封膜；打开Flex电源，开始运行程序进行提取。

1.2.3 STR复合扩增及分型

使用AmpFlSTR Identifiler PCR扩增试剂盒（美国AB公司），9700型PCR扩增仪（美国AB公司）扩增。反应总体积25uL，其中模板DNA 10uL，反应混合液10 uL，引物混合液5 uL。3130XL遗传分析仪（美国AB公司）对扩增产物进行电泳分离。

2 结果与讨论

112例纺织样本和130例作案工具采用两种方法进行提取，以检出15个STR基因座和性别基因座作为检出标准，其余作为未检出标准。

结果显示，ML-超微量磁珠法在纺织品上检出率为58.0%，Chelex-100检出率则为45.5%，两种提取方法在纺织品上检出情况，经卡方检验，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。ML-超微量磁珠法在作案工具上检出率为41.5%，Chelex-100检出率则为33.8%，经卡方检验，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表1 两种提取方法在112例纺织品上的检出情况比较（n＝112）

表2 两种提取方法在130例作案工具上的检出情况比较（n＝130）

现场遗留的纺织品和作案工具用两种提取方法的检出率不同，采用ML-超微量磁珠法提取检出率高于Chelex-100，且Chelex-100提取的DNA STR分型峰值在200以下，等位基因扩增不均衡，小片段优势扩增，大片段等位基因丢失。而ML-超微量磁珠法提取的DNA STR分型峰值一般在400左右，等位基因扩增STR分型完整，图谱峰高均衡，优于Chelex-100提取的效果（图1）。两种提取方法对于粗糙、易渗透客体（纺织品）的检出率高于作案工具的检出率，可能与衣物等纺织类用品与人体表面的接触面积大，接触时间长，而硬质的作案工具与人体接触面积小，接触部位不确定及犯罪嫌疑人有可能带有手套有关。

Chelex-100是苯乙烯和二乙烯基苯的共聚体，它包含成对的亚氮基乙酰乙酸，可螯合多价金属离子，如镁离子，将镁离子从反应体系去除之后，降解DNA的核酸酶就会失活，从而保护DNA分子。这种提取方法适用范围广泛，易于操作，且价格低廉。整个操作过程在EP管中完成，没有损失和消耗，因此回收率高，没有二次污染。但是，Chelex-100法不能去除DNA溶液中的杂质和降解的DNA片段，也容易出现等位基因扩增不平衡，甚至小片段优势扩增导致大片段等位基因缺失的现象[2]。对于污染少、杂质少的检材，可以选择Chelex-100作为提取方法。

图1 两种不同提取方法在纺织品上的STR图谱比较

ML-超微量磁珠法利用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA分子被磁珠吸附，而蛋白质分子不被吸附游离在溶液里。在磁场作用下，磁珠与溶液分离，然后回收颗粒，再用纯水洗脱颗粒。ML-超微量磁珠法单次运行可以纯化1～96个样本，减少操作人员的工作量；有效避免人工操作可能引起的差异，减少污染并提高结果的可重复性；它通过超强磁棒转移样品，液体零残留，磁珠回收效率大于99%。

与Chelex-100法相比，ML-超微量磁珠法能有效的去除100 bp以下的杂质，可以调整DNA洗脱液的量对样本进行浓缩，因此获得的DNA分子纯度高，峰高比较均衡，小片段优势扩增不明显。因此适合于微量、有污染的检材的提取。

[1]陈松，李万水，胡兰，等.微量DNA：容易忽略的生物物证[J].刑事技术，2004（S）：19-22.

[2]杨电，张丽萍，刘超，等.Chelex-100和两种磁珠法提取接触性DNA效果的比较[J].刑事技术，2012，（1）：11-13.

（本文编辑：李成涛）

DNA Extraction from Exfoliated Cells:Comparison between ML-Super Micro Beads Method and Chelex-100 Method

WANG Ke,SU Xiao-wei,PAN Cheng,TANG Ke,LIXing-ye,PENG Cheng,YAO Xue,SHANG Lei-peng
（Haidian Branch Criminal Investigation Detachment,Beijing Municipal Public Security Bureau,Beijing 100142,China）

Objective To compare the extraction rate of DNA from exfoliated cells by ML-ultra micro beads method（KingFisher Flex）and Chelex-100 method,thus optimizing the extraction method in forensic practice.M ethod The parallel extraction of DNA from the same sample（textiles or tools）was carried out by two extraction methods,and the results were compared with common STR.Result Among 112 textile samples，the detection rate of ML-micro beadsmethod and Chelex-100method was 58%and 45.5%,respectively.The difference was statistically significant（χ2＝7.00,P＜0.05）.Among 130 pieces of crime tool samples,the detection rate of ML-micro beadsmethod and Chelex-100 method was 41.5% and 33.8%,respectively.The difference was also statistically significant（χ2＝4.55,P＝0.03）.Conclusion ML-micro beads method（KingFisher Flex）hasmore advantages in the extraction of DNA from exfoliated cells.

forensic genetics;ML-ultramicro beadsmethod（KingFisher Flex）;Chelex-100;STR test;exfoliated cell

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2017.02.007

1671-2072-（2017）02-0052-03

2016-09-02

王珂（1986—），女，主检法医师，硕士，主要从事法医物证学工作研究。E-mail:252810117@qq.com。