柚皮素通过PI3K/Akt通路拮抗血小板聚集的体外研究*

黄曼婷， 吴焕林， 徐丹苹△

(1广州中医药大学第二临床医学院，2广东省中医院，广东 广州 510020)

柚皮素通过PI3K/Akt通路拮抗血小板聚集的体外研究*

黄曼婷1， 吴焕林2， 徐丹苹2△

(1广州中医药大学第二临床医学院，2广东省中医院，广东 广州 510020)

目的： 探讨柚皮素拮抗二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的作用及机制。方法：采用血小板聚集仪观察不同浓度柚皮素对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响。采用荧光显微镜观察柚皮素对血小板在固化纤维蛋白原上扩展功能的影响。采用Western blot检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)表达及蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。结果：柚皮素能剂量依赖性地抑制ADP诱导的体外血小板聚集，其半数抑制浓度(IC50)值为(132.1 ± 31.7)μmol/L。柚皮素灌胃给药，对ADP诱导的大鼠体内血小板聚集也有明显的抑制作用。柚皮素还能显著抑制血小板在固化纤维蛋白原上的扩展。Western blot结果显示，柚皮素能明显抑制ADP刺激的PI3K表达和Akt磷酸化，同时，PI3K广谱抑制剂LY294002能增强柚皮素对Akt磷酸化的抑制作用。结论：柚皮素可能通过抑制血小板PI3K/Akt信号通路发挥抗血小板聚集的作用。

柚皮素； 血小板聚集； 二磷酸腺苷； PI3K/Akt信号通路

血小板是循环在血液中的一种没有细胞核的颗粒，主要功能是参与止血与血栓形成。它们以非活化的形式在机体中循环，直到它们接触到内皮细胞的缺损区或遇到凝血级联反应才被活化，此时血小板黏附于内皮细胞的缺损部位，发生形变，释放颗粒内容物，包括二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)、5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)等，并相互黏附形成聚集物，进一步促进血小板活化。与此同时能引发多个信号通路的交叉反应，尤其是内源性的信号扩增机制，诱导整合素的“由内-向外”信号转导，激活整合素αIIbβ3，引起血小板黏附和聚集，最终触发整合素诱导的 “由外-向内”信号转导，促进血小板颗粒的进一步释放及增加血小板聚集的稳定性[1-2]。不恰当的或过度的血小板活化会导致急性血管阻塞，比如急性心肌梗死的发生，在冠状动脉或者颈动脉的动脉粥样硬化中，血小板也牵涉其中[3]。血小板聚集和血栓形成是心脑血管病的主要致病因素，因此，抗血小板治疗已成为目前心脏病治疗中不可或缺的一种手段，开发新型、安全有效的抗血小板聚集药物，用于防治心脑血管疾病是一项紧迫任务。

柚皮素是柚皮苷的苷元，属于二氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物——葡萄、葡萄柚、西红柿以及柑橘类水果中，也是中药化橘红的主要有效成分。近年来国内外药理研究表明，柚皮素具有抗氧化、抗炎、抗心律失常、调节脂代谢以及预防动脉粥样硬化等多种药理活性，在防治心脑血管疾病方面越来越受到重视，可被开发应用于医药、食品等领域。我们前期研究发现柚皮素能抑制ADP诱导的血小板聚集，但是其抗血小板的机制未进行深入探讨。本研究通过体外实验探讨柚皮素抗血小板聚集可能的机制，为寻找新的抗血小板负性调节靶点提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 主要材料与仪器

柚皮素购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度大于98.0%；阿司匹林购自阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度为99%；硫酸氢氯吡格雷片购自赛诺菲制药有限公司；ADP、鬼笔环肽、前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)、纤维蛋白原、apyrase购自Sigma-Aldrich；LY294002购自Abcam；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)p110 β Ⅰ抗、磷酸化Akt (Ser 473) Ⅰ抗、Akt Ⅰ抗、GAPDH Ⅰ抗、辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgGⅡ抗购自Cell Signaling Technology；West Pico 化学发光底物购自Pierce Biotechnology；PVDF膜购自Millipore。LBY-NJ4血小板聚集仪为北京普利生仪器有限公司产品。

2 方法

2.1 洗涤血小板的制备[4-5]正常SD大鼠以10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉穿刺取血，用3.2%枸橼酸钠溶液与血以1∶9的比例抗凝，向混匀的全血中加入PGE1(终浓度0.1 mg/L)，将全血混匀后，300×g离心6 min。吸取上层血浆，加入PGE1(终浓度0.1 mg/L)，900×g离心10 min，弃去上清液，得到浓缩血小板团块，加入适量Tyrode buffer (12 mmol/L NaHCO3、138 mmol/L NaCl、5.5 mmol/L glucose、2.9 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、0.42 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L HEPES，pH 7.4)及PGE1(终浓度0.1 mg/L)，巴氏吸管轻柔吹打，重悬血小板。900×g离心5 min，弃去上清液，得到血小板团块，重悬血小板沉淀于含2×10-5U/L 腺苷三磷酸双磷酸酶的Tyrode buffer 中，血小板终浓度调整至4×1011/L。

2.2 富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)的制备[6]SD大鼠随机分为5组，每组6只：正常对照组、柚皮素低剂量组、柚皮素中剂量组、柚皮素高剂量组、氯吡格雷组。柚皮素低、中、高剂量组分别灌胃给予200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg柚皮素，氯吡格雷组灌胃给予氯吡格雷7.875 mg/kg，正常对照组给予等体积生理盐水。每天灌胃1次，共7 d。于末次给药1 h后，腹主动脉取血，用3.2%枸橼酸钠溶液与血浆以1∶9的比例抗凝，血样经1 000 r/min离心10 min，取上层液即为PRP，剩余血液以3 000 r/min离心10 min，得贫血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP)。用PPP调整血小板计数为4×1011/L，进行血小板聚集功能测定。

2.3 血小板聚集功能测定[7-8]按Born比浊法进行血小板聚集性测定。用300 μL Tyrode buffer 作为参比，于比浊管中加入洗涤血小板300 μL，不同浓度药物各5 μL，37 ℃孵育5 min后，加入诱导剂ADP(终浓度10 μmol/L)，并记录300 s 内最大聚集率(用ADP诱导洗涤血小板聚集，必须加入2 mmol/L CaCl2和0.3 g/L人纤维蛋白原)。

2.4 血小板在纤维蛋白原上的扩展 洁净的圆形盖玻片(截面厚200 μm)用50 mg/L纤维蛋白原(200 μL) 4 ℃包被过夜，次日吸出过夜包被的纤维蛋白原溶液，PBS洗涤盖玻片2次后，加入1% 牛血清白蛋白溶液常温静置60 min，吸出封闭液。洗涤血小板(4×1011/L)预先加入不同浓度的柚皮素孵育5 min，然后把血小板滴在纤维蛋白原包被的盖玻片上，放置于5% CO2培养箱内37 ℃孵育45 min，用PBS轻轻冲洗3次，把未黏附的血小板冲走，然后用4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS冲洗3次，避光加入200 μL鬼笔环肽(1 mg/L)，暗室放置60 min后吸除，PBS洗涤3次，用荧光显微镜观察黏附的血小板，记录并及时保存。

2.5 Western blot 检测蛋白水平 血小板聚集反应结束后，马上将洗涤血小板放于冰上终止反应。3 000×g离心3 min，得血小板沉淀，用PBS洗2次，加入适量细胞裂解液，置冰上裂解30 min，12 000×g离心10 min，所得上清即为细胞总蛋白。留取20 μL裂解后的样本进行BCA蛋白定量，剩下的样本加入5×loading buffer，100 ℃煮5 min，分装，-80 ℃保存。取40 μg样本上样，将样本电泳、转膜，用5% BSA室温封闭1 h，洗膜3次。分别加入特异性抗体(PI3K p110β、Akt、p-AktSer 473、GAPDH)，室温轻柔振动孵育1 h后，放入4 ℃冰箱孵育过夜。洗膜3次后，加入Ⅱ抗，室温孵育1 h，洗膜3次。使用ECL化学发光，用凝胶成像仪成像。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行统计分析，结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 柚皮素对血小板聚集的影响

10 μmol/L ADP能诱导洗涤血小板发生较强的聚集，5 min内最大聚集率为(66.8±3.1)%， 分别用100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L和800 μmol/L柚皮素预处理洗涤血小板后，血小板聚集率明显降低，对应的聚集率分别为(38.5±4.4)%、(26.7±8.1)%、(7.7±1.0)%和(4.9±1.6)%,与单纯ADP刺激组(对照组)比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。其中，柚皮素抑制ADP诱导的血小板聚集的IC50值为(132.1±31.7)μmol/L。灌胃给予不同剂量的柚皮素(200、400、800 mg/kg)均显著抑制ADP引起的血小板聚集，且抑制作用呈现剂量依赖性。在高剂量时，柚皮素对ADP引起的血小板聚集的抑制作用与氯吡格雷相当，见图1。

Figure 1.Naringenin inhibited ADP-induced platelet aggregation in vitro and in vivo. A: the rat washed platelet aggregation performed in the presence or absence of various concentrations of naringenin was recorded after stimulation with 10 μmol/L ADP; B: effect of naringenin on ADP-induced platelet aggregation in rats in vivo. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

Figure 2.Naringenin inhibited rat platelet spreading on immobilized fibrinogen. The platelet spreading was visualized under fluorescence microscope. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control.

2 柚皮素对血小板在纤维蛋白原上扩展的影响

如图2所示，血小板在固定化的纤维蛋白原上作用45 min后，可以完全地铺展，其铺展面积百分率为(30.37±3.31)%。当分别用100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L的柚皮素作用5 min后，血小板在纤维蛋白原上的铺展受到了明显的抑制，呈剂量相关性(P<0.01)，铺展面积百分率与对照组相比分别下降到了(20.96±5.08)%、(15.29±1.87)%、(10.56±0.79)%和(6.98±2.74)%。

3 柚皮素对PI3K表达和Akt磷酸化的影响

ADP刺激血小板活化可使PI3K蛋白水平明显增高，柚皮素处理能明显抑制PI3K的表达，见图3。当ADP刺激血小板后会增加Akt的磷酸化，柚皮素可以显著抑制Akt的磷酸化，见图4。

Figure 3.Naringenin inhibited PI3K expression in ADP (10 μmol/L)-stimulated platelets. R: resting platelets. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

4 PI3K抑制剂LY294002对Akt磷酸化的影响

我们使用PI3K广谱抑制剂LY294002进一步明确柚皮素对PI3K/Akt活化的影响。实验结果显示，单独使用较低浓度的LY294002或柚皮素不能完全抑制Akt磷酸化，二者合用时可以进一步抑制Akt磷酸化，说明柚皮素和PI3K抑制剂具有协同抑制Akt磷酸化作用，见图5。

讨 论

Figure 4.Naringenin inhibited Akt phosphorylation in ADP (10 μmol/L)-stimulated platelets. R: resting platelets. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 5.The effect of naringenin on Akt phosphorylation in ADP-stimulated platelets. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs ADP group; #P<0.05 vs ADP+naringenin.

ADP是第一个已知的低分子血小板弱活化剂，它对血小板功能有决定性的作用。当血小板活化后，ADP从血小板致密颗粒中释放，作为二次激动剂，通过作用于多种受体，增强自身及其它血小板诱导剂的效果，放大血小板反应，并有助于血栓的稳定化[9]。人类血小板至少表达2个明确的ADP受体，分别为P2Y1和P2Y12，它们属于G蛋白偶联受体的嘌呤能类。ADP引起的血小板最佳活化需要P2Y1和P2Y12的活化[10]。Gq偶联的P2Y1受体介导磷脂酶C的β亚型活化，导致细胞质的Ca2+水平暂时升高、整合素αIIbβ3活化、血小板变形和聚集。Gi偶联的P2Y12受体可以使腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)下调，从而降低环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)浓度，同时激活PI3K的β、γ受体，最终活化鸟苷三磷酸酶，抑制环磷酸鸟苷生成，减少对磷酸二酯酶的抑制，从而使cAMP降解，最终导致血小板聚集[11]。由于P2Y12只在血小板和脑中表达，相对于P2Y1更有选择性，因此目前抗ADP受体的药物主要是针对P2Y12受体的。

近年来，PI3K-Akt信号通路在血小板聚集和稳定血栓中的作用越来越受到重视。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，在血小板的功能反应和血栓形成方面发挥重要作用[12]。根据其基本结构、调节方式和作用底物的不同，PI3K可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型(PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ和PI3Kγ)均发现在人和鼠血小板中表达，是与血小板密切相关的、研究比较成熟的亚型[12]。近年来，越来越多研究表明，PI3Kp110β在动脉血栓形成血小板作用方面处于核心地位。一系列研究发现PI3Kp110β抑制剂或PI3Kp110β缺陷，均能影响血小板的活化和防止动脉血栓的形成，并提出PI3Kp110β有可能成为抗血栓药物的新靶点[13-16]。我们观察了柚皮素对PI3Kp110β蛋白表达的影响，实验结果显示，用ADP刺激血小板活化可使PI3Kp110β表达显著升高，同时，柚皮素处理均可显著抑制ADP诱导的PI3Kp110β蛋白表达。Akt是PI3K下游的信号分子，PI3K的激活能导致Akt的磷酸化，Akt是一个广泛被接受的PI3K/Akt信号通路的活化标志。Akt在介导血小板颗粒释放、血小板聚集和血栓形成中起重要作用，因此，PI3K/Akt信号通路已经成为一个新兴的治疗血小板相关疾病的靶点[17-18]。我们的研究发现，柚皮素可以抑制ADP诱导的Akt磷酸化，并呈剂量相关性，200 μmol/L柚皮素即可明显抑制Akt的磷酸化，表明柚皮素通过抑制PI3K-Akt信号通路从而发挥抗血小板聚集作用的。进一步对PI3K活性分析显示，柚皮素和PI3K抑制剂具有协同抑制Akt磷酸化的作用，而PI3Ks可以被酪氨酸激酶调控[19]，从而表明柚皮素抑制效果的产生可能与对酪氨酸激酶信号通路的影响有关。

整合素受体αIIbβ3在血小板中介导了2种信号通路[“由内-向外”的信号通路(inside-out)和“由外-向内”的信号通路(outside-in)]。血小板的聚集反映了inside-out信号，上述实验已证实柚皮素能调控这一信号。血小板在纤维蛋白原上的扩展实验可以反映柚皮素对outside-in信号的调控。我们的研究结果显示柚皮素能明显抑制血小板在固化纤维蛋白原上的扩展。血小板与纤维蛋白原的结合主要依赖整合素αIIbβ3 介导的inside-out这一信号转导过程，柚皮素可以有效抑制这个过程，而血小板在纤维蛋白原上的扩展是依赖于αIIbβ3 介导的outside-in信号转导过程的，柚皮素同样能有效抑制这一过程，而αIIbβ3介导的inside-out和outside-in 2个过程均受PI3K调控[15-16]，这表明柚皮素可能通过PI3K/Akt这一过程发挥抗血小板作用的。

综上所述，柚皮素可以抑制ADP诱导的洗涤血小板聚集，同时可以抑制血小板扩展功能。柚皮素抗血小板作用的潜在分子机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关，这将为其防治心脑血管疾病的研究提供实验依据。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Antiplatelet aggregation of naringenin via inhibiting PI3K/Akt signalinginvitro

HUANG Man-ting1, WU Huan-lin2, XU Dan-ping2

(1TheSecondClinicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,2GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510020,China.E-mail:danpingxu@hotmail.com.cn)

AIM: To investigate the antiplatelet aggregation of naringenin and its possible mechanism. METHODS:The effects of naringenin at different concentrations on adenosine diphosphate (ADP)-induced platelet aggregation and platelet spreading on immobilized fibrinogen were detected by aggregational detector and observed under fluorescence microscope, respectively. The expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and the phosphorylation of Akt were analyzed by Western blot.RESULTS:Naringenin significantly inhibited ADP-induced platelet aggregation in a dose-dependent mannerinvitroandinvivo, and inhibited platelet’s spreading on immobilized fibrinogeninvitro. Further studies indicated that naringenin inhibited platelet activation accompanied by attenuating not only the activation of PI3K, but also the phosphorylation of Akt. Moreover, naringenin combined with LY294002 additively inhibited the ADP-induced platelet aggregation. CONCLUSION: Naringenin may inhibit platelet activation by regulation of PI3K/Akt signaling pathway.

Naringenin; Platelet aggregation; Adenosine diphosphate; PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2017)03- 0517- 06

2016- 09- 26

2016- 11- 15

国家自然科学基金资助项目(No. 81403341)；广东省中医药管理局科技专项(No. 20141093)；广东省科技计划项目(No. 2016A020226011)

△通讯作者 Tel: 020-39318374; E-mail: danpingxu@hotmail.com.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.022