重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

隋 丽，王 豫，关 华，孔福全，周平坤

（1.中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850；2.中国原子能科学研究院，北京102413）

·基础研究·

重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

隋 丽1，2，王 豫1，关 华1，孔福全2，周平坤1

（1.中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850；2.中国原子能科学研究院，北京102413）

DNA双链断裂（DSB）是电离辐射所致基因组DNA的主要和最严重的损伤类型，磷酸化组蛋白γH2AX能比较特异地在DSB处形成焦点，是DSB的分子标志物之一。比较了重离子7Li、12C与γ射线辐照小鼠MEF细胞诱发γH2AX焦点的规律特征。结果显示，诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数目与照后时间相关，表达峰值出现在照后2 h，但不同类型辐射高表达的持续时间不同。在相同剂量下，致焦点形成率与辐射的LET值相关，LET值越高，形成率越大。γ射线诱发的γH2AX焦点尺寸随照后时间无明显变化，高LET重离子诱发的γH2AX焦点尺寸随时间变化先增加后减小；与低LET的γ射线相比，高LET辐射诱发的焦点平均尺寸明显变大，LET越高焦点尺寸越大且保持时间越长。

基因组稳定性；DNA双链断裂；DNA修复；磷酸化组蛋白H2AX聚焦点；重离子；γ射线

1 引言

基因组DNA是放射损伤的关键靶，DNA损伤是引发包括早期确定效应或组织反应和远后致癌效应在内的健康危害的放射生物学原初效应［1］。DNA双链断裂（DNA Double⁃Strand Break，DSB）是电离辐射诱发的众多DNA损伤中最为关键的一种，它的正确和完全修复可保证细胞的存活和基因组的稳定，而错误修复和残余DNA损伤将导致细胞的死亡、突变和发生恶性转化［2⁃4］。当DSB发生时，与基因组DNA密切接触的组蛋白H2AX在其 SQE基序上的第139丝氨酸迅速发生磷酸化修饰，并聚焦于 DSB处，在数量上与DSB位点形成一一对应的磷酸化H2AX焦点，即γH2AX foci［5⁃8］。因此，通过γH2AX特异性抗体和分子免疫荧光激光共聚焦技术检测γH2AX，可以确定细胞中DNA双链断裂损伤的发生和修复情况。进一步通过激光共聚焦显微镜的断层扫描优势，可克服非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，提高分辨率和图像清晰度，实现在细胞中的精确定位、定量和斑点尺寸变化规律的分析。借助此技术，本文研究比较了重离子与γ射线照射小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）诱发的DNA双链断裂损伤修复及γH2AX焦点的尺寸效应。

2 实验材料与方法

2.1细胞培养

实验采用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），由美国哥伦比亚大学放射生物学中心Tom Hei教授提供，本实验室保存。细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液、饱和湿度、37℃恒温和5%二氧化碳的培养箱中培养。DMEM和胎牛血清均购自Hyclone公司。为了便于免疫荧光实验，辐照前24小时将细胞接种和生长于盖玻片上。

2.2细胞辐照

实验分别使用2 Gy剂量的12C离子、7Li离子和γ射线辐照细胞。

12C离子辐照在中国科学院近代物理研究所的重离子加速器上进行，离子的能量为300 MeV／u，对应在水中的LET值为12.6 keV／μm，射程约为15 cm，剂量率为0.35 Gy／min。因为粒子束流为水平出射，所以在辐照前先将置有细胞爬片的培养皿中的培养液倒掉，再将培养皿面向束流接受辐照，辐照完毕后立即加入培养液继续进行培养。

7Li离子辐照在中国原子能科学研究院的HI⁃13串列加速器装置上进行，离子的能量为37.3 MeV，对应在水中的LET值为70.2 keV／μm，射程约为300 μm，剂量率为0.33 Gy／min。

γ射线（LET为0.2 keV／μm）辐照在军事医学科学院放射与辐射医学研究所60Co辐照装置上进行，样品辐照方法同重离子照射，辐照剂量率为0.22 Gy／min。

2.3 γH2AX的免疫荧光检测及定量分析

细胞受照后立即置于37℃恒温、饱和湿度的5%二氧化碳培养箱中继续培养。在照后0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h的不同时间点收取长有细胞的玻片，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，用4℃预冷的 4%多聚甲醛固定过夜。PBS洗 3× 10 min，0.3%Triton⁃100冰上透化15 min，然后使用3%的胎牛血清白蛋白（BSA）封闭1 h，再用抗γH2AX的一抗（购自 Upstate）按1∶200稀释后4℃孵浴过夜，1%BSA洗3×5 min。接着使用荧光标记的山羊抗小鼠二抗（FITC）按1：1000稀释后室温孵育1 h，再用PBS洗3×5 min，DAPI对细胞样品染色5 min，PBS洗3×5 min，10%甘油封片，最后用扫描激光共聚焦显微镜40×物镜观察γH2AX焦点。对于每一个样品，均随机选取5个不同区域进行扫描成像，细胞统计数不少于100个。每个细胞核内的γH2AX焦点同时使用人工和Image J（National Institutes of Health）图像分析软件两种方法进行统计，以验证结果的可靠性。每个γH2AX焦点的大小由Image J软件定量得到。

2.4统计学分析

实验结果中所有数据用SPSS统计软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析及t检验进行统计分析，所有统计结果均以平均数±标准方差表示。

3 结果与讨论

3.1 γ射线、12C和7Li重离子照射细胞诱发γH2AX焦点的变化规律

图1（a）为激光共聚焦扫描显微镜观测到的小鼠成纤维细胞MEF在2 Gy γ射线辐照后0.5～24 h不同时间点的γH2AX焦点变化情况。从图中可以直观地看到，与对照细胞相比，照后0.5 h细胞中的γH2AX焦点数量就有了明显增多。随着时间的增加，γH2AX焦点的表达出现先增后减的变化趋势。而且，辐照后细胞核中的γH2AX焦点基本呈现为均匀和分散的分布规律，即使在焦点数很多的细胞中也是如此，体现了γ射线稀疏电离辐射的特性。

对不同时间点细胞样品中的γH2AX焦点和细胞数进行统计，得到了平均每个细胞中γH2AX焦点随时间的变化情况（图1（b））。在照后0.5 h焦点数就增加到了1.54个，约为对照样品中的13倍。随着时间的推移，焦点数继续上升，至2 h时达到最大值2.4个，之后开始下降，但趋势极为缓慢，到24 h时基本恢复到本底水平，尤其在8 h之后至24 h进入比较全面的修复阶段。

以每个细胞中的γH2AX焦点数为统计对象，得到了细胞中焦点数量的分布情况。图1（c）给出了辐照后0.5 h、2 h和8 h的不同γH2AX焦点数细胞的分布图。可以看到，对于这三个时间点来说，有45%～50%的细胞没有观察到γH2AX焦点。每个细胞中形成的焦点数量，以1～3个为最多，占到了25%～35%。其次是4～6个和7～9个，分别占到了10%～15%和4%～5%，其中8 h点略占优势。数量介于10～15个的在2 h和8 h时出现，比例为3%～5%，其中2 h点比例略高于8 h。而数量大于19的只出现在2 h，且仅占了不到1%。由此可见，从2 h到8 h这段时间内，每个细胞中的焦点数量在逐渐减少，这一变化趋势暗示了细胞的缓慢修复过程。此外，对于γ射线辐照后每一个时间点来说，焦点数量越少的细胞在细胞总数中占的比例越多。

图2给出了12C重离子以2 Gy剂量辐照MEF细胞后，在0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h的不同时间点，细胞中γH2AX焦点的变化情况。由图2（a）可见，γH2AX焦点直观图像的变化趋势与γ射线类似，即随着时间的推移，呈现先增加后减少的变化规律。但在相同时刻，与γ射线相比，形成焦点的数量多、尺寸大。而且焦点多在核内的局部区域成簇出现，与γ射线诱发的均匀和分散的分布规律截然不同。

图2 （b）为12C离子辐照后，每个细胞平均γH2AX焦点数随照后时间变化的动力学曲线。从整体变化趋势看，它与γ射线诱发的相同，即焦点数量先增加而后减少。形成的焦点数量上，在2 h之前（含2 h）各时间点和24 h高于γ射线，但在4～8 h期间又低于γ射线，而且与其自己的2 h点相比，4 h点数量减少了28%。很明显，12C离子辐照后24 h，细胞中焦点的数量相对较高，提示12C离子由于其高能和高 LET值，在局部范围内电离密度较高，可能会形成相对多的不易修复的簇集DSB，导致DNA残留损伤的增加。

图2（c）为12C离子辐照后0.5 h、2 h和8 h单个细胞中形成的γH2AX焦点数量的细胞分布图。从整体看，分布规律与 γ射线的相似，焦点数集中于柱状图的左侧，即较少焦点区域。不同之处是，在2 h和8 h点，无 γH2AX焦点的细胞所占比例减少了25%。而且形成的γH2AX焦点数量在1～18个范围内分布，同比所占比例明显高于γ射线产生的，尤其是在照射后8 h出现一个含有16～18个焦点数细胞分布次高峰期。这说明12C离子在细胞核单位面积上诱发的γH2AX焦点数更多，反映出了高能量的12C离子在穿过细胞时，沉积的能量强于γ辐射。此外，重离子还有可能干扰了细胞的氧化应激系统，致使局部产生代谢性高浓度的自由基，导致继发性 DNA损伤的发生。

图3（a）给出了7Li离子以2 Gy剂量辐照MEF细胞后，在0.15 h、0.5 h、1 h、2 h、8 h和24 h的不同时间点，细胞中γH2AX焦点的观察结果。可见，焦点量的变化趋势与 γ射线和12C离子类似，即随着时间的推移，呈现先增加后减少的变化规律。但在相同时刻，与 γ射线甚至12C离子相比，形成焦点的数量多，尺寸大。而且焦点多在核内的局部区域成簇出现，有些甚至呈斑块状。

图3 （b）为7Li离子辐照后不同时间点，平均每个细胞中γH2AX焦点数的定量结果。如图所示，焦点数在照后0.25 h就激增到了2.2个，接近γ射线的最高表达水平。随着时间的增长，焦点数急剧上升，到2 h时达到峰值，约为0.25 h时的3倍，γ射线相同时间点的2.8倍，随后开始逐渐减少，8 h时减为峰值的83%。之后继续减少，至24 h时变为0.24个，约为本底水平和γ射线相同时间点的2倍。γH2AX焦点数在照后0.25～2 h急剧增加现象的一种可能解释是，在7Li辐照后的细胞中，存在大量的非双链断裂DNA集簇性损伤，这些损伤在细胞的修复过程中双链DNA的两条在相临近的位点被同时切割而转化为新的双链断裂，随着时间的延长，这些损伤又被逐渐修复，因而又出现逐渐减少的现象，体现了细胞中针对复杂的集簇损伤的修复机制的存在。

图3（c）为7Li离子辐照后0.5 h、2 h和8 h单个细胞中形成的γH2AX焦点数量的细胞分布图。对于2 h仅有6%没有出现焦点，表明此时绝大多数细胞中的DNA都发生了双链断裂。而且2 h与其它两个时间点相比，焦点数的分布区间明显后移，表明2 h时刻每个细胞中出现了更多的焦点，由图中可见仅在数量为1～3个或16～18个的范围内的细胞略少，其它各处均高于另外两点，特别是表达7～15个和19～21个焦点数的细胞明显较多。8 h与0.5 h相比，出现γ⁃H2AX焦点的细胞有所增多，且γ⁃H2AX数量为7～21个的细胞显著多于0.5 h。与γ射线相比，7Li离子辐照后，各时间点未出现γ⁃H2AX焦点的细胞明显减少，这是因为7Li离子是具有高LET的射线，相比低LET的γ射线而言，它的径迹结构复杂，局部剂量大，通过自由基攻击和细胞间信号传递能诱发更多的细胞DNA发生双链断裂。

3.2重离子与γ射线诱发γH2AX焦点尺寸大小的变化规律

DNA依赖蛋白激酶（DNA⁃PK）是DNA损伤应答和双链断裂修复中的一个关键分子，有研究报道，在缺乏DNA⁃PK激酶活性的细胞中观察到高LET辐射诱发大尺寸的γH2AX焦点的存在，但其详细的产生和变化规律及生物意义尚不清楚［7］。图4（a）为2 Gy γ射线辐照后0.5 h、2 h和8 h时，细胞中不同大小尺寸γH2AX焦点的分布规律。可见，在这三个时间点，70%的焦点分布在0.8 μm2以下，并以0.2～0.4 μm2的较小焦点为最多，约达到了总焦点数的一半或一半以上。尺寸在1.0～1.8 μm2的中等大小和大于2 μm2的较大焦点也有出现，所占比例依时间不同而有所差别，2 h时刻最多，其次是 8 h和 0.5 h。0.5 h、2 h和8 h三个不同时间点的γH2AX焦点尺寸大小的平均值没有差别（图4（b））。

2 Gy12C离子辐照后细胞中γH2AX焦点大小的分布如图4（c）所示。与γ射线相比，大于1 μm2以上的焦点有所增多，特别是在2 h时间点出现了较多的大于2 μm2的焦点。图4（d）为12C离子诱发γH2AX焦点的平均尺寸的测量结果，表明形成焦点的平均最大尺寸约为γ射线的1.5倍。γH2AX焦点尺寸大小的差异，很可能与重离子诱发的DNA双链断裂为复杂的集簇性损伤有关。γH2AX焦点尺寸大小可成为表征细胞修复和辐射敏感性的一个生物学参数。

图4 （e）和（f）给出了7Li离子辐照后0.5 h、2 h和8 h细胞中γH2AX焦点大小的分布情况。同样，与γ射线的结果相比，在相同时间点，7Li离子辐照后的焦点大小的分布谱明显向较大尺寸方向移动，而且分布谱的范围变宽，在大于2 μm2的范围出现了峰值，以2 h点最多，达到了约25%，其次是0.5 h和8 h，相同时间点在比例上较γ射线增加了2倍多，在具体尺寸上也显著增大。这些大尺寸焦点是7Li离子径迹直接诱发产生的，每一个焦点代表了一个集簇性基因组DNA损伤。而那些小尺寸的焦点，则可能是由δ射线、次级粒子或旁效应诱发而成。另外，结果还显示，对于7Li离子来说，8 h时焦点尺寸有向较小尺寸变化的趋势，提示细胞进入了损伤修复阶段。细胞中焦点的平均尺寸的结果如图4（f）所示，可见，焦点大小呈现为明显地先增后减的趋势，从0.5 h的1.1 μm2增加到2 h的2.0 μm2，至8 h点降为1.2 μm2，表明了双链断裂损伤开始产生、加重到缓慢修复的反应过程。与γ射线相比，相同时间处7Li离子诱发形成的焦点的平均尺寸要大，尤其是在2 h点，约为γ射线的2.2倍。与12C离子相比，在分析的这三个时间点，诱发的效应整体较大，大尺寸焦点的形成率也明显多。此外，与低LET的γ射线不同，7Li离子辐照后形成的焦点在数量和大小上均具有时间响应，12C离子辐照也产生类型的效应现象，表明了高LET辐射与细胞中DNA相互作用的不同机制。

4 结论

本研究通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜扫描技术，观测了不同LET值的7Li（70.2 keV／μm）、12C（12.6 keV／μm）和γ射线（0.2 keV／μm）辐照MEF细胞诱发γH2AX聚焦点及DNA双链断裂损伤修复的效应规律。与低LET的γ射线相比，具有较高LET的12C离子和高LET的7Li离子诱发的DNA双链断裂的损伤更严重。本研究从γH2AX焦点大小变化，描述了不同类型辐射诱发DNA双链断裂损伤点即电离辐射诱发焦点（IRIF）的尺寸效应。2 Gy不同品质射线（包括7Li、12C和γ射线）辐照MEF细胞后，诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数具有时间响应性，最大值均出现在照后2 h，效应的强弱依次为7Li离子＞12C离子＞γ射线。不同射线诱发的γH2AX焦点高表达持续时间不同，γH2AX焦点大小与LET值相关，LET越高诱发的焦点平均尺寸越大，焦点尺寸的变化有可能作为表征不同类型辐射作用、辐照集簇DNA断裂损伤及细胞修复过程的参数。

（References）

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（责任编辑：庞迎春）

Response of γH2AX Foci in Repair of DNA Double Strand Breaks Induced by Heavy Ions

SUI Li1，2，WANG Yu1，GUAN Hua1，KONG Fuquan2，ZHOU Pingkun1

（1.Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China；2.China Institute of Atomic Energy，Beijing 102413，China）

DNA double⁃strand break（DSB）is a major and severe damage of genomic DNA induced by ionizing radiation.In case of the occurrence of DSB，the histone protein H2AX is phosphorylated and recruited at DSB site to form phosphorylated H2AX（γH2AX）foci as a DSB biomarker.The yield，size and dynamics of γH2AX foci in mouse MEF cells induced by different linear energy transfer（LET）radiation including heavy ions7Li，12C and60Co γ⁃ray were investigated.The results indicated that the average number of γH2AX foci per cell was changed as a function of time post⁃ir⁃radiation for all the radiations，and the peak of γH2AX foci formation appeared at 2h after irradia⁃tion.The persistence of increased number of foci was depended on the radiation type.The frequency of γH2AX foci production was associated with the LET value，the higher the LET，the greater the production frequency.The average size of γ⁃H2AX foci induced by γ⁃rays was not changed with the post⁃irradiation times.An increase in the size of γH2AX foci induced by high LET ion beams was found，as compared with γ⁃rays irradiation.Moreover，the foci size increased with elevated LET.

genomic stability；DNA double⁃strand break；DNA repair；γH2AX foci（phosphoryla⁃ted H2AX foci）；heavy ion；γ⁃ray

Q691.5；Q789

：A

：1674⁃5825（2017）02⁃0245⁃07

2016⁃05⁃19；

2017⁃02⁃28

载人航天预先研究项目（040101）

隋丽，女，博士，研究员，研究方向为重离子辐射生物学与防护。Email：lisui＠ciae.ac.cn