人腺病毒及其分型方法研究进展

陈晓飞，刘琪琦，周伟，张五星，李颖

1.解放军第309医院，北京 100091；2.军事医学科学院，北京 100850

人腺病毒及其分型方法研究进展

陈晓飞1，2，刘琪琦2，周伟1，张五星1，李颖1

1.解放军第309医院，北京 100091；2.军事医学科学院，北京 100850

人腺病毒是引起婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原体，还可引起其他系统感染。在临床表现方面与其他病原微生物的感染比较相似，仅根据临床表现诊断疾病比较困难，需要实验室的诊断证实。腺病毒的致病谱根据血清型的不同而不同，而其血清型是由分子结构中高变区的特异抗原决定的，特定血清型与疾病的严重程度、临床表现密切相关，所以腺病毒的检测分型尤为重要。本文就腺病毒的分子结构、流行特点及检测分型方法进行简要综述。

人腺病毒；分子结构；分型方法

腺病毒最早是在人体的扁桃体组织中发现的，经培养、鉴定后，确定为一种新病毒[1]。腺病毒感染多发于婴幼儿和军队，近年来，腺病毒引起的呼吸道感染时有暴发，疫情具有发展快、感染性强的特点，病情严重者危及生命[2]，影响了婴幼儿和士兵的健康。因此，我们要做好腺病毒感染的预防控制工作，同时也对腺病毒的检测及分型提出了更高的要求。

1 腺病毒的分子生物学特点

腺病毒是一种无包膜球形DNA病毒颗粒，直径65～90 nm。腺病毒的分子结构主要包括两部分：一是由蛋白构成的外层衣壳，包含240个六邻体蛋白和顶角的12个五邻体蛋白，六邻体蛋白是型特异性蛋白，而五邻体蛋白是群特异性蛋白，每个五邻体上伸出一条具有血凝特性的纤突，从而使病毒颗粒类似于通讯卫星样构型；二是衣壳内包裹的双链DNA遗传物质，整个基因组长约38 kb[3]，根据复制时间将DNA分为早期转录基因和晚期转录基因，早期转录基因表达调节蛋白，晚期转录基因表达结构蛋白[4]。

根据文献报道确定了68个腺病毒型别[5]。依据生物学特性的不同，国际病毒学分类委员会（ICTV）将1～52血清型划分为A～G共7个亚属[6]，A、F和G主要引起消化道感染、腹泻，C、E和部分B亚属主要引起呼吸道疾病，其他B亚属主要引起尿路感染，D亚属主要引起角膜炎和结膜炎[7]。53～68型是通过高通量测序技术确定的新型腺病毒，都是由2个或多个腺病毒株重组产生的[8-11]，且多发生在同一种属的不同型别之间，A、B、C、D亚属中均有重组发生[12]。由于新毒株的感染特性和母病毒株不同[13-14]，这些病毒必须进行全基因组测序和重组分析才能明确其生物学特性和基因特征。

2 腺病毒的流行特点

腺病毒感染可引发呼吸系统、胃肠系统、泌尿系统及眼部疾病，如肺炎、腹泻、膀胱炎、结膜炎等[15]。腺病毒的传染源主要是腺病毒感染者，显性感染者发病初期感染性最强，隐性感染者传染作用较大，危害较大。腺病毒的传播途径主要是飞沫传播，感染者的呼吸道分泌物可在空气中保持半小时，另外还可经粪口传播和接触传播。腺病毒的易感人群有两类：一是免疫力低下的婴幼儿。婴幼儿腺病毒感染可引起严重的肺炎或支气管炎，甚至有致命的危险。钱渊等[16]对北京地区呼吸道腺病毒感染儿童的研究，发现以腺病毒3、7型为主，其次是11、14型。腺病毒55型是腺病毒11和14型重组而成的新型腺病毒，2006年在陕西首次出现，造成1名患儿死亡[17-18]。二是生活在聚居环境的新兵，根据全军传染病专业委员会编写的《腺病毒感染诊疗指南》，部队多起腺病毒疫情的病原为腺病毒55、7和14型[19]。腺病毒感染导致的急性呼吸道疾病是基层部队冬春常见的传染病，2011～2013年我国部分地区军营中共发生8期腺病毒感染疫情。2012年腺病毒55型在河北保定和北京军营开始传播。医学统计表明，新兵腺病毒感染率通常超过50%，其中20%～40%发展为肺炎且须住院治疗。

3 腺病毒的分型方法

病毒分离法、免疫学方法和分子生物学方法是用于临床和实验室检测的传统方法。病毒分离法通常被认为是诊断腺病毒感染的金标准。常用A549和HeLa细胞培养临床标本中的腺病毒，除血清型40和41外，其他血清型在人上皮细胞系上生长良好，会导致细胞圆缩，出现核内包涵体聚集成串等病变现象，通过观察这些特征性细胞致病作用（CPE）来分离腺病毒。该方法耗时长（通常要21 d），需要良好的技术和典型的细胞病变，不能大规模应用于临床快速、准确的检测。酶联免疫吸附试验（ELISA）用于定性和（或）定量检测人血清和血浆中抗腺病毒的IgA/IgG抗体，它包括对人体致病的所有血清型，用于诊断和鉴别诊断腺病毒的急性感染。以上两种方法均不能区分具体血清型别。但由于腺病毒血清型众多、致病谱广、全球范围内流行[20]，且有与其他病毒混合感染的趋势[21-22]，需要检测具体的血清型别。中和试验和血凝抑制试验是常用的分型方法。中和试验通过直接检测腺病毒六邻体蛋白的抗原决定簇，血凝抑制试验则根据五邻体蛋白的抗原决定簇检测结果判定血清型[23]。随着分子生物技术的不断发展，PCR扩增法、基因测序和生物芯片在腺病毒的分型鉴别中更具优势。

3.1 PCR扩增法

PCR扩增法是目前应用最多的一种分子诊断方式，包括常规PCR、多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR。它主要以腺病毒特异基因hexon的高度可变区为基础，根据不同血清型基因核酸序列特点设计引物和探针，在特定的反应体系和反应条件下，通过扩增特异性目的片段进行分型。可以在数小时分析出结果，快速地对腺病毒进行血清型鉴定。多重PCR对腺病毒符合感染的诊断效果较好，荧光定量PCR在型别检测的同时还能对病毒量进行判断。

3.2 环介导等温扩增法

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增技术，针对靶基因的6个不同区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，于60～65℃恒温环境，经起始阶段和扩增循环阶段，实现核酸不停地自我循环合成。它具有灵敏度高、特异性好、操作简单的特点[24-26]。由于腺病毒的疾病谱较广，可以利用LAMP技术进行针对性检测[27]，如Ziros等[28]检测了腺病毒40和41型，李凡等[29]检测了腺病毒3、7和14型，赵娜等[30]检测了腺病毒7、14和55型。但LAMP技术也存在对引物设计要求较高，不能实现高通量的不足。

3.3 基因测序法

测序是对基因序列最准确、直观的表达。随着新一代测序技术的发展，测序速度提高，成本有所降低，有望用于诊断。通过对腺病毒基因组中变异最大的区域，即编码六邻体蛋白、五邻体蛋白和纤维蛋白的区域进行测序，可以快速准确地确定其型别。目前，测序主要应用在两个方面：一是流行病学调查。Tohma等对40例腺病毒样本的六邻体蛋白编码区测序，确定为3型和7型腺病毒[31]。二是腺病毒新型别的确定。新型重组型腺病毒（52～67型）都是基于全基因组测序分析而确定的[32]，Robinson认为DNA测序及生物信息学分析是识别腺病毒新型别的主要方法。

3.4 基因芯片技术

基因芯片技术是伴随人类基因组计划的实施而发展起来的，它以高通量、高灵敏度、高特异、微型化和平行化的特点，被逐渐用于病毒的基因分型，其原理是把病毒分型探针固定在基片上制成芯片，与PCR产物杂交，观察信号强弱进行分型。基因芯片技术操作简单、检测样本量大，它的运用将大大提高腺病毒分型效率[33-34]。

综上所述，腺病毒所致的疾病谱较广，不仅可以引起呼吸道疾病和肠道疾病，还可引起全身其他系统的疾病，这与其型别有密切关系。近来，由于重组变异产生了许多新型腺病毒并且导致混合感染的增多，因此需要快速准确的分型检测方法。与病毒分离和免疫学方法相比，分子生物学方法具有快速、高灵敏度、高特异性的优势，被广泛用于腺病毒的分型检测。以PCR技术为基础的基因测序和基因芯片技术具有高通量的特点，可以快速准确地检测大量样本，在腺病毒疫情暴发后可为疾病治疗争取时间，提高应对突发疫情的能力，也可指导临床诊断及监测预后。

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Research Progress of Adenovirus and its Classification Methods

CHEN Xiao-Fei1,2,LIU Qi-Qi2*,ZHOU Wei1*,ZHANG Wu-Xing1,LI Ying1
1.309thHospital of PLA,Beijing 100091;2.Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China

Human adenovirus is the main pathogen of the acute respiratory infection in infant,and it also can in⁃fect other systems.It is difficult to diagnose the disease according to the clinical maifestation,because it is simi⁃lar with other pathogenic microorganism in clinical manifestations.Thus,we need laboratory diagnosis.The sero⁃type is decided by hypervariable region specific antigen of molecular structure.Different serotype have different pathogenic spectrum,so the adenovirus serotyping detection is particularly important.In this paper,we summarized the molecular structure and detection of adenovirus serotyping methods.

human adenovirus;molecular structure;serotyping methods

R373

A

1009-0002（2017）05-0700-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,ZHOU Wei,E-mail:cxiaofei0805@163.com;LIU Qi-Qi,E-mail:shuixiyinhexl@sina.com

2017-01-12

重大新药创制科技重大专项（2015ZX09J15105-001-001）

陈晓飞（1988- ），女，硕士，（E-mail）1191040061@qq.com

周伟，（E-mail）cxiaofei0805@163.com；刘琪琦，（E-mail）shuixiyinhexl@sina.com