蛋白质印迹法中免染技术和总蛋白定量方法的研究进展

韩欣霖，杨佳儒，宝福凯 ，柳爱华

1.昆明医科大学 a.云南省高校热带传染病重点实验室；b.热带医学研究所；c.病原生物学与免疫学系；d.生物化学与分子生物学系；云南 昆明 650500；2.云南省公共卫生与疾病防控协同创新中心，云南 昆明 650500；3.云南省热带病示范型国际科技合作基地，云南 昆明 650500

蛋白质印迹法中免染技术和总蛋白定量方法的研究进展

韩欣霖1a，1c，杨佳儒1a，1d，宝福凯1a，2，1b，1c，3，柳爱华1a，2，1b，1d，3

1.昆明医科大学 a.云南省高校热带传染病重点实验室；b.热带医学研究所；c.病原生物学与免疫学系；d.生物化学与分子生物学系；云南 昆明 650500；2.云南省公共卫生与疾病防控协同创新中心，云南 昆明 650500；3.云南省热带病示范型国际科技合作基地，云南 昆明 650500

当含有蛋白质的SDS-PAGE胶浸泡在三氯乙酸或氯仿中时，经三氯化合物的作用，使得蛋白质中的色氨酸经紫外光照射会发出可见光，因而可在SDS-PAGE凝胶上实现对蛋白质条带的定位与定性。免染技术即是基于此原理而发明的。基于免染技术，我们可以检测到待测样品中的总蛋白条带的光密度，进而利用目的蛋白条带光密度与总蛋白条带光密度的比值对目的蛋白进行定量。本文就蛋白质印迹法技术中的免染技术和总蛋白定量方法的原理和优势进行简要综述。

免染技术；β肌动蛋白（β-actin）；β微管蛋白（β-tublin）；甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）；总蛋白定量

自1979年首次应用以来，蛋白质印迹法（Western blot）已成为测定复杂生物样品中蛋白质相对表达的关键技术。使用Western印迹的生物化学分析是确定复杂生物样品中相对蛋白表达量的重要工具，Western印迹通常与大规模筛选技术如蛋白质组学结合使用，以确认各种疾病模型中不同目的蛋白的表达[1]。虽然成像和试剂技术在不断提高灵敏度、动态检测范围和多重目标检测的适用性方面已经取得了显著进步，但是在最基本的技术上几乎没有变化。在过去，蛋白质印迹仅用于检测复杂混合物中的特定靶蛋白，但是现在许多学术期刊要求作者在样品之间蛋白质表达的倍数变化方面对Western印迹数据进行定量解释[2]。近年来开发了新方法，涵盖了完整的Western印迹工作流程，重点是样品制备和数据分析的定量免疫印迹方法。

1 内参蛋白定量和总蛋白定量的比较

蛋白质印迹用于特异性地测量复杂生物样品中目蛋白的相对表达量。定量测量可能由于过程不一致而产生误差，例如转膜时蛋白质转移不均匀，包括样品制备和加样错误，以及转膜时蛋白质转移不均匀。这些非样本相关误差需要通过归一化的方法来弥补。目前通常采用2种数据标准化方法：内参蛋白（house keeping protein，HKP）标准化和总蛋白标准化（total protein nor⁃malization，TPN）[3]。

1.1 β-actin等内参蛋白在Western印迹实验中不是一个可靠的上样对照[4]

传统上，由于缺乏累积发光线性和有限的定量再现性，使用ECL（增强化学发光）的Western印迹被称为半定量技术[5]。随着更敏感的荧光标记的发展，其表现出比常规ECL检测更大的可量化的线性范围、灵敏度和稳定性，蛋白质表达的分析可以被合理地称为“定量”[6]。因此，必须以更高的精确度确保样品上样的均匀性，以避免在使用这些更高分辨率的工具时错误的数据采集[7]。为了准确测量样品中的蛋白质水平，“上样对照（loading control）”蛋白质通常用作内参。上样对照通常来自普遍表达的看家基因，并且由于它们在不同范围的样品中特定的一致的表达水平而被广泛使用。β肌动蛋白（β-actin）和甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是生物医学研究中最常用的2种内参对照，然而越来越多的研究表明它们在动物和实验模型中的表达存在差异[4,8-11]。

已有研究表明，在运动神经元病症脊髓性肌萎缩（SMA）的小鼠模型的病理学影响的组织中，β-actin和β-tublin差异表达[12-13]。该研究使用建立的严重SMA的小鼠模型，从中得到脊髓组织，来量化β-actin和β-tublin的蛋白表达水平。当使用Western印迹定量（QWB）来比较SMA小鼠受影响的脊髓与对照组织时，发现了β-actin和βtublin表达水平的改变。与对照组织相比，SMA组织中的β-actin和β-tublin表达显著下调。该研究从一系列疾病模型的受累组织中可以检测到对照蛋白表达的显著改变，鉴定了健康（野生型）组织中内参蛋白表达的差异性，并且确定了在同一个体内不同组织中内参蛋白的表达同样存在差异。该实验使用C57B1/6（野生型）小鼠的研究表明，当比较同一小鼠的不同组织时，β-ac⁃tin的表达显著不同。在心脏和脾脏组织之间观察到β-actin蛋白表达的显著差异，当比较这些组织时，将数据归一化用于不同组织比较，β-actin蛋白表达可以因此导致数据偏斜高达22倍。然而，该实验同样证明了在某些组织如骨和脂肪之间的β-actin表达存在同源性，也就是说，在这些组织中，可以将β-actin作为内参蛋白使用，但也仅在这些特定的组织中能够使用。例如，鱼类中实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的研究与该研究的发现相一致，该研究证明β-actin在心脏、肌肉和脑的某些组织中不是理想的加样对照，但其在肾脏和脾脏的表达结果一致，可作为内参蛋白[14]。此外，更进一步的研究表明在不对称组织中，βactin等常作为加样对照的内参蛋白的表达量也是不均一的。例如，在比较坐骨神经近端到远端部分时，相比之下，神经丝（NF-L）（神经元细胞骨架的主要组分）的表达明显更高[15]，接近8倍，在坐骨神经的远端部分达到4倍SEM。因此，这些结果强调，即使对单个动物的相同组织用于比较分析时，解剖的准确性和一致性也是至关重要的。此外，有研究证明内参蛋白在不同组织或在暴露于感染因子后表达量也不同[14]。因此，根据内参蛋白定量产生的数据可能导致错误的结果。

1.2 总蛋白定量是一种测定蛋白上样量的精确方法

在选择QWB内参过程中需要考虑几个重要的变量因素，包括敏感度的线性范围、不同组织或同一组织中蛋白质的表达量差异等。为了确定QWB实验中总蛋白分析法是否是一种精确、可靠的检测蛋白上样量方法，有研究者用牛血清白蛋白（BSA）经梯度稀释法建立了蛋白标准品，并以此评估检测灵敏度[1]。BSA的相对分子质量为66 500，在该处可以检测到线性荧光条带，并且在很大的浓度范围内都存在良好的线性关系，与其0.998的变异系数一致。重要的是，BSA标准品溶液有效证明了信号条带的强弱很好地代表了蛋白质上样量的变化。这不仅证明了使用该方法检测蛋白质的良好线性关系，也证明此方法中不存在通常出现于ECL蛋白检测法中的色彩饱和度问题。最终，当应用LICOR Odyssey定量扫描系统检测真正的生物样品时，在很大的蛋白浓度范围内检测蛋白质上样量时总蛋白定量法（使用考马斯亮蓝）都有着优于内参蛋白β-actin和β-tubulin的良好线性（1～40 μg）。BCA法和总蛋白定量法的变异系数分别为0.979和0.996，表明这2种方法都具有良好的线性。此外，在蛋白质溶液上样量的范围大至1～40 mg时，总蛋白分析得出的数据仍与BCA法所得出的数据具有非常直接的相关性，进一步说明总蛋白定量是一个非常可靠的蛋白质上样量对照。因此，我们认为总蛋白定量提供了一种可避免单一蛋白对照所带来的各种问题的测定蛋白上样量的方法。总蛋白定量的优点如下：①在来自不同模型的不同组织中，它是稳定不变的；②在不同类型的组织中，它是稳定的；③在同一组织的不同部位中，它是稳定的。总蛋白定量是QWB中一种简单的技术，用来准确地确定在凝胶内是否已达到等同的蛋白质载量[16]。通过总蛋白定量获得的数据避免了用内参蛋白产生的误差。这并不意味着看家基因不能用做上样对照，在明确掌握解剖结构和内参蛋白表达的情况下，可以引用内参蛋白，但是相比之下，总蛋白定量应用的范围和精确度更广更好，因此，建议使用总蛋白定量以节省时间、资源，增加灵敏度和准确度，并且不必考虑将内参蛋白作为上样对照时的限制问题。因此，总蛋白定量应被作为现代荧光定量Western印迹中数据标准化的替代参考标准[17]。

2 免染技术基本概念

2002年，《Analytical Biochemistry》上的一篇文章中第一次提到免染技术（stain free）。免染技术主要包括2个部分，即免染胶和Chemi Doc MP全能成像系统，分析结果时需要Image Lab软件。免染胶与普通的预制胶不同，免染胶包含特有的免染技术，因此不能用预制胶代替。样品制备及电泳步骤与普通电泳一样。电泳后，取出凝胶，置于Chemi Doc MP全能成像系统中。通过电泳分离的蛋白经特定波长的紫外线（UV）照射而激活，产生荧光，从而被CCD照相机捕获，1～2 min即能显示总蛋白条带，Image Lab软件根据蛋白marker自动估算各条带的相对分子质量和数量。

2.1 免染技术原理

免染技术利用可以在预制胶内使用的化学物质，在凝胶制剂中掺入三卤代化合物，当暴露UV辐射时，其催化三卤代化合物和色氨酸残基之间的共价反应。所得的“活化的”蛋白质在UV激发下发荧光，可以通过合适的成像系统在凝胶内或在转移到印迹膜之后检测[18]。

2.2 免染技术的优点

免染技术为Western印迹工作流程中的数据标准化提供了一种新型的质控工具[3]。免染法能够检测和校正实验过程中的误差。免染技术显示出在整个Western印迹过程中的更多优势。通过免染法可在Western印迹过程中提前检测到相关严重问题，并且在抗体孵育之前停止。能够及时检测到抗体孵育之前的凝胶性能和蛋白质转膜情况，节省大量时间，并且避免之后的资源浪费。免染技术体现了现有的基于染色法的总蛋白定量方法的优势，常见的TPN染色包括丽春红染色液、Sypro Ruby蛋白质印迹免染和考马斯亮蓝R-350。De Medina等报道[19]丽春红染液的线性范围高达140 μg，但是其染色时间长，信噪比低，重复性差。Aldridge等检测了[17]Sypro Ruby印迹染色对脑匀浆的稀释样品（每个泳道22～41 μg蛋白质）的性能，发现染色在其特定工作浓度范围内呈线性。然而，Sypro Ruby染色需要不断的时间消耗，并且更适用于各泳道大于50 μg的蛋白上样量。Welinder和Ekblad报道了[16]在免疫检测GAPDH后用考马斯亮蓝R-350作为总蛋白染色方法，它们通过SDS-PAGE从细胞裂解物中分离2～25 μg总蛋白，证明了该染色法在该范围内的线性。然而，它们的总蛋白染色方法仅限于PVDF膜，因为考马斯亮蓝染色导致硝酸纤维素膜上非常高的背景。

免染技术的另一个显著优点是快速显现凝胶电泳分离蛋白质和转膜的能力。此外，免染技术兼容硝酸纤维素膜和PVDF膜。免染技术以成像系统标准化和无偏差的方式进行数据采集处理。数据标准化的传统方法是基于各种HPK的表达水平一致的认识之上，但目前利用免染技术进行总蛋白定量被认为是检测细胞裂解物总蛋白质含量的良好代表。越来越清楚的是，HPK方法在其一般适用性方面受到限制。任何蛋白质作为标准化对照的第一个先决条件是证明在所研究的样品中稳定表达[20]。因此，合适的内参蛋白选择需要消耗一定的时间去验证[21]。此外，基于HKP的标准化需要对抗体稀释、孵育时间和成像设置进行优化。与免染技术相比，这是一个非常漫长的过程，免染技术总蛋白定量的方法提供了精确的蛋白质上样载量，而不需要长时间的优化完善。此外，HKP定量方法基于每个电泳道的单个蛋白质的比较，而免染技术的总蛋白质定量方法利用了给定蛋白质样品中的所有信息。

3 蛋白样品制备是实验可信度的先决条件

蛋白样品的制备可直接影响蛋白质印迹上条带的光密度，以下列出几项蛋白样品制备时可能遇到的问题：①组织或细胞样本的处理不当会导致蛋白质样品降解和/或表达；②裂解缓冲液中清洗剂、盐和蛋白酶抑制剂不足；③BCA试剂盒测定蛋白浓度不准确。

由于蛋白裂解物与污染物如细胞或组织碎片、脂肪、疏水蛋白聚集体、核酸和蛋白酶的复杂性，可对Western印迹结果产生直接和负面的影响，因此使用细胞裂解缓冲液和匀浆技术消除其影响非常重要[22]。通常，含有非离子洗涤剂如NP-40和Triton X-100的缓冲液比离子洗涤剂如SDS和脱氧胆酸钠产生的刺激更小。通常加入浓度为100～150 mmol/L的盐（如NaCl或KCl）以防止蛋白质凝集。RIPA缓冲液［1%NP-40或Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，150 mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl（pH7.8），1mmol/L EDTA］和蛋白酶抑制剂混合物用机械或手动仪器产生匀浆，这可以为Western印迹结果的测定提供可靠的数据。组织匀浆技术的正确选择是Western印迹测定成功的先决条件，并且所采用的方法完全取决于样品类型。其中一个方法是，对于细胞裂解，将沉淀的细胞（在细胞悬浮液的情况下）加入冰冷（4℃）的RIPA缓冲液或铺板的细胞中，将细胞洗涤后，将冰冷的RIPA缓冲液直接加入板中，刮下并吸取细胞。来自细胞或组织裂解物的匀浆的总蛋白浓度应使用BCA法测定。理想地，匀浆将被稀释至至少2 mg/mL的浓度，这将允许每个泳道10～80 μg 1 mm厚的微型聚丙烯酰胺SDS凝胶上样。

4 结语

蛋白质印迹分析是最广泛使用的对目的蛋白质进行半定量测定的方法之一。Western印迹实验耗时长，包含许多操作步骤（如蛋白质浓度测定、SDS-PAGE、转膜），会增加很多带入误差的几率[3]。为了准确比较蛋白质印迹信号，必须补偿信号强度（与样品本身无关），这种方法被称为归一化，并且在本领域中被广泛运用。使用蛋白质印迹的蛋白质的半定量通常涉及针对看家蛋白（如β-actin）的标准化。为了校正可能存在的蛋白质上样的不准确性，一般都会增加具有相对恒定表达的“看家蛋白”作为内参载量对照。这些蛋白质在许多不同的样品中含量丰富，并且它们的表达水平通常被认为对各种生理条件和处理的影响不敏感。2种最常用的内参对照是βactin和GAPDH。然而，几个最近的报告表明，以看家蛋白作为内参对照须仔细评估。选择HKP时应当谨慎，因为不是所有的HKP表达水平在实验条件或不同样品类型的变化下保持恒定，常用于数据标准化的HKP包括β-actin[23]、β-tublin[24]和GAPDH[25]。TPN利用加载在给定泳道中的整个样品的信号强度作为靶蛋白信号的加载对照。由于在各种实验条件下存在HKP表达变化的可能，通常建议使用多个HKP标准化Western印迹结果，从而增加实验的时间和复杂性。相比之下，TPN的使用具有使单个蛋白质的表达变化的影响最小化的优点。最近，丽春红染色和考马斯亮蓝染色已被证明是作为上样对照的管家基因的合适替代物。免染技术的总蛋白染色具有无须染色或脱色步骤的优点。使用免染技术作为β-ac⁃tin或蛋白质染色液的替代品的评价显示，基于免染法总蛋白定量的方法优于β-actin等内参蛋白，并且优于作为蛋白质印迹上样对照的丽春红染色等染色方法。

通过良好的样品制备技术、检测方法、软件和分析的共同协作，能够实现蛋白质印迹的准确密度计量分析，这些分析最终能够产生十分满意的结果。为了获得最大程度的重复和完整性，强烈推荐运用基于免染技术的总蛋白定量方法，因为这种方法为免疫印迹实验过程中数据的精确标准处理提供了新颖独特的质控工具。

[1]Eaton S L,Roche S L,Hurtado M L,et al.Total pro⁃tein analysis as a reliable loading control for quantita⁃tive fluorescent Western blotting[J].PLoS One,2013,8:e72457.

[2]Taylor S C,Posch A.The design of a quantitative western blot experiment[J].Biomed Res Int,2014,2014(1):361590.

[3]Gürtler A,Kunz N,Gomolka M,etal.Stain-free technology as a normalization tool in Western blot analysis[J].Anal Biochem,2013,433(2):105-111.

[4]Dittmer A,Dittmer J. β-actin is not a reliable load⁃ing control in Western blot analysis[J].Electrophore⁃sis,2006,27(14):2844-2845.

[5]Zellner M,Babeluk R,Diestinger M,et al.Fluores⁃cence-based Western blotting for quantitation of pro⁃tein biomarkers in clinical samples[J].Electrophoresis,2008,29(17):3621-3627.

[6]Gingrich J C,Davis D R,Nguyen Q.Multiplex detec⁃tion and quantitation of proteins on western blots us⁃ing fluorescent probes[J].Biotechniques,2000,29(3):636.

[7]Aoki K,Yamada M,Kunida K,et al.Processive phos⁃phorylation of ERK MAP kinase in mammalian cells[J].ProcNatlAcad SciUSA,2011,108(31):12675-12680.

[8]Suzuki O,Koura M,Noguchi Y,et al.Use of sample mixtures for standard curvecreation in quantitative Western blots[J].Exp Anim,2011,60(2):193.

[9]Wishart T M,Pemberton H N,James S R,et al.Mod⁃ified cell cycle status in a mouse model of altered neuronal vulnerability(slow Wallerian degeneration;Wl⁃ds)[J].Genome Biol,2008,9(6):1-21.

[10]Mutsaers C A,Wishart T M,Lamont D J,et al.Re⁃versible molecular pathology of skeletal muscle in spi⁃nal muscular atrophy[J].Human Mol Genet,2011,20(22):4334-4344.

[11]Castaño Z,Kypta R M.Housekeeping proteins:limita⁃tions as references during neuronal differentiation[J].Open Neurosci J,2008,2(1):36-40.

[12]Monani U R,Sendtner M,Coovert D D,et al.The hu⁃man centromeric survivalmotorneuron gene(SMN2)rescues embryonic lethality in Smn(-/-)mice and re⁃sults in a mouse with spinal muscular atrophy[J].Hu⁃man Mol Genet,2000,9(3):333.

[13]Murray L M,Comley L H,Thomson D,et al.Selec⁃tive vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and post-synaptic pathology at the neuromuscu⁃lar junction in mouse models of spinal muscular atro⁃phy[J].Human Mol Genet,2008,17(7):949.

[14]Dang W,Sun L.Determination of internal controls for quantitative real time RT-PCR analysis of the effect of Edwardsiella tarda infection on gene expression in turbot(Scophthalmus maximus)[J].Fish Shellfish Immu⁃nol,2011,30(2):720-728.

[15]Hirokawa N,Glicksman M A,Willard M B.Organiza⁃tion of mammalian neurofilament polypeptides within the neuronal cytoskeleton[J].J Cell Biol,1984,98(4):1523-1536.

[16]Welinder C,Ekblad L.Coomassie staining as loading control in Western blot analysis[J].J Proteome Res,2011,10(3):1416-1419.

[17]Aldridge G M,Podrebarac D M,Greenough W T,et al.The use of total protein stains as loading controls:an alternative to high-abundance single protein con⁃trols in semi-quantitative immunoblotting[J].J Neuro⁃sci Methods,2008,172(2):250.

[18]Ladner C L,Yang J,Turner R J,et al.Visible fluo⁃rescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining[J].Anal Biochem,2004,326(1):13-20.

[19]Romerocalvo I,Ocón B,Martínezmoya P,et al.Revers⁃ible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots[J].Anal Biochem,2010,401(2):318-320.

[20]Greer S,Honeywell R,Geletu M,et al.Housekeeping genes;expression levels may change with density of cultured cells[J].J Immunol Methods,2010,355(1-2):76-79.

[21]Li X,Bai H,Wang X,et al.Identification and valida⁃tion of rice reference proteins for Western blotting[J].J Exp Botany,2011,62(14):4763.

[22]Gräslund S,Nordlund P,Weigelt J,et al.Protein pro⁃duction and purification[J].NatMethods,2008,5(2):135-146.

[23]Zhang R,Yang D,Zhou C,et al. β-actin as a load⁃ing control for plasma-based Western blot analysis of major depressive disorder patients[J].Anal Biochem,2012,427(2):116-120.

[24]Liu N K,Xu X M.beta-tubulin is a more suitable in⁃ternal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury[J].J Neu⁃rotrauma,2006,23(12):1794.

[25]Wu Y,Wu M,He G,et al.Glyceraldehyde-3-phos⁃phate dehydrogenase:a universal internal control for Western blots in prokaryotic and eukaryotic cells[J].Anal Biochem,2012,423(1):15-22.

Progress of Stain-Free Technology and Total Protein Analy⁃sis in Western Blotting

HAN Xin-Lin1a,1c,YANG Jia-Ru1a,1d,BAO Fu-Kai1a,2,1b,1c,3*,LIU Ai-Hua1a,2,1b,1d,3*
1.a.Yunnan Province Key Laboratory for Tropical Infectious Diseases in Universities;b.Institute for Tropical Medicine;c.Department of Microbiology and Immunology;d.Department of Biochemistry and Molecular Biology;Kunming Medical University,Kunming650500;2.Yunnan Province Integrative Innovation Center for Public Health,Diseases Prevention and Control,Kunming 650500;3.Yunnan Demonstration Base of International Science and Technology Cooperation for Tropical Diseases,Kunming 650500;China

Based on the principle that after UV stimulation,the tryptophan will emit visible light when a SDSPAGE gel containing proteins be soaked in the trichloroacetic acid or chloroform,the stain-free technology was in⁃vented.By means of stain-free technology,we can examine the optical density（OD）value of total protein in sam⁃ples and then,we can quantify the target protein through utilizing the OD value ratios between target protein and total proteins.Here,we summarized the principle and advantages of the stain-free technology and the total protein analysis method.

stain-free technology;β-actin;β-tublin;GAPDH;total protein analysis

Q51

A

1009-0002（2017）05-0709-06

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,BAO Fu-Kai,E-mail:baofukai@kmmu.edu.cn;LIU Ai-Hua,E-mail:liuaihua@kmmu.edu.cn

2017-04-01

国家自然科学基金（81371835，31560051，81560596）

韩欣霖（1992- ），女，硕士研究生；杨佳儒（1987- ），男，硕士研究生；二者为共同第一作者

宝福凯，（E-mail）baofukai@kmmu.edu.cn；柳爱华，（E-mail）liuaihua@kmmu.edu.cn