几种淫羊藿提取物中淫羊藿黄酮的分离

武 博， 刘 春 莹， 郭 美 娟， 李 鹤， 鱼 红 闪， 金 凤 燮

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

几种淫羊藿提取物中淫羊藿黄酮的分离

武 博， 刘 春 莹， 郭 美 娟， 李 鹤， 鱼 红 闪， 金 凤 燮

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

研究了从4种淫羊藿提取物中分离朝藿定A、B、C和淫羊藿苷单体的方法。原料淫羊藿提取物中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的质量比为5.95∶11.0∶24.6∶58.5。100 g原料经D-280大孔树脂柱吸附结晶得到20.1 g纯度90.0%以上淫羊藿苷；其母液浓缩得到29.8 g的淫羊藿混合黄酮，其中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷质量比为10.8∶18.8∶44.3∶26.2，无法用结晶法分离淫羊藿苷。结果表明，利用硅胶柱法分离淫羊藿苷和朝藿定A、B、C，其产物纯度分别为95.0%、91.0%、90.5%、93.0%。

淫羊藿黄酮；淫羊藿苷；朝藿定；大孔树脂；硅胶柱

0 引 言

淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿总黄酮和淫羊藿多糖[1]，其总黄酮具有防抑郁、抗肿瘤、抗氧化和增强机体免疫力等功能[2]。淫羊藿茎叶中含有40余种淫羊藿黄酮，但80%～90%的黄酮类化合物为淫羊藿苷(Icariin)、朝藿定A(Epimedin A)、朝藿定B(Epimedin B)、朝藿定C(Epimedin C)[3]。淫羊藿黄酮的分离提取方法主要有醇提取法、机溶剂萃取法、水提法、超声波和微波提取法、大孔树脂吸附、制备色谱分离法等[4-5]。已有文献中只是对淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷分离的初步研究，其操作方法不系统，提取率不理想，且没有关于淫羊藿苷和朝藿定A、B、C 4种淫羊藿黄酮单体的分离的报道。因此，本实验以几种市销的淫羊藿提取物为原料，利用大孔脱色树脂、硅胶柱分离法得到几种淫羊藿黄酮单体。

1 材料与方法

1.1 材 料

淫羊藿苷标准品，朝藿定A、B、C；市售淫羊藿提取物样品，淫羊藿苷质量分数20%；其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 D-280大孔树脂制备淫羊藿苷

称取淫羊藿提取物，溶解于10倍体积的60%乙醇溶液中，上样于同体积的预先处理过的D-280大孔树脂柱中，反复脱色3～4次，再用12倍柱体积的60%乙醇溶液洗脱，将脱色液减压浓缩、结晶，收集沉淀，用50%的冰冻乙醇溶液洗涤2次，干燥后得到淫羊藿苷。其母液再经D-280大孔树脂柱脱色、洗脱、减压浓缩、干燥得到淫羊藿混合黄酮，用于硅胶柱分离淫羊藿黄酮单体。

1.2.2 硅胶柱分离母液中的淫羊藿混合黄酮

取分离淫羊藿苷后的淫羊藿混合黄酮4 g，与45 mL四氢呋喃-乙醇溶液、10 g 80～100目硅胶混合，水浴中搅拌蒸干，制备成样品胶，再放入预先装入80 g的300～400目的玻璃柱上层。先用乙酸乙酯通柱，再用洗脱剂洗脱，每瓶收集80 mL；用TLC方法检测收集的洗脱液中合并单点洗脱液，减压蒸馏、干燥，分别得到其单体。

1.2.3 淫羊藿黄酮的检测

TLC检测：展开剂为体积比为8∶7∶1∶1的乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水混合液，测定254 nm处OD，并以各标准品为参比。

HPLC检测[6]：Waters2695高效液相色谱分析仪；色谱柱，中汇达Kromasil C18柱(5 μm，φ250 mm×4.6 mm)。流动相，乙腈(A)-水(B)：0～8 min，17%～27% A；8～32 min，27% A等梯度；32～60 min，27%～85% A线性梯度；60～70 min，85% A等梯度；70～80 min，85%～90% A；进样量，10 μL；柱温，35 ℃；体积流量，1.0 mL/min；检测波长，273 nm。

称取朝藿定A、B、C、淫羊藿苷标准品、待测样品各2 mg，分别加10 mL 50%乙醇，制成0.2 mg/mL 的标准品溶液和待测样品；经0.45 μm 滤膜过滤，待用。

2 结果与讨论

2.1 市销淫羊藿提取物原料成分分析

分别对市售的淫羊藿提取物样品进行HPLC检测，结果如图1所示。表1为3种样品提取物中主要黄酮的含量。从图1和表1可知，3种淫羊藿提取物中主要黄酮为淫羊藿苷、朝藿定A、B和C；其中淫羊藿苷含量最高，在总黄酮中质量分数为朝藿定A最低。

(a) 样品Ⅰ

(b) 样品Ⅱ

(c) 样品Ⅲ

图1 3种样品中淫羊藿提取物成分的HPLC图

Fig.1 HPLC result of epimedium extract components in three samples

表1 3种淫羊藿提取物样品中主要黄酮的

2.2 D-280大孔树脂分离制备淫羊藿苷

3种淫羊藿提取物中50%以上黄酮为淫羊藿苷；以样品Ⅰ为原料，分离制备淫羊藿苷。100 g淫羊藿提取物经纯化得到淫羊藿苷20.1 g，纯度为95.0%。母液经处理得到淫羊藿混合黄酮29.8 g；用HPLC法检测，结果如图2、表2所示。由表2可知，淫羊藿苷的质量分数从原料中的58.5%降为26.2%，在此条件下很难用结晶法分离淫羊藿苷，因此利用硅胶柱进行分离母液的淫羊藿混合黄酮。

2.3 硅胶柱法分离淫羊藿混合黄酮

称取淫羊藿混合黄酮4 g，经TLC方法分离、收集，分别得到淫羊藿苷110 mg，朝藿定A50 mg、朝藿定B 30 mg、朝藿定C 220 mg；经HPLC检测，淫羊藿苷纯度为95.0%，朝藿定C纯度为93.0%，朝藿定A和B的纯度分别91.0% 和90.5%。检测结果分别如图3、4所示。

图2 母液中淫羊藿混合黄酮的HPLC图

表2 母液的淫羊藿混合黄酮的HPLC数据分析

i，淫羊藿苷标准品；A，朝藿定A标准品；B，朝藿定B标准品；C，朝藿定C标准品；样，淫羊藿混合黄酮；1，产物淫羊藿苷；2，产物朝藿定A；3，产物朝藿定B；4，产物朝藿定C单体

图3 TLC检测硅胶柱分离淫羊藿混合黄酮的结果

Fig.3 TLC result of mixed epimedium flavonoids separated by silica gel column

结果表明，当母液的淫羊藿混合黄酮中淫羊藿苷质量分数较低且无法用结晶法分离时，可以用硅胶柱法分离得到淫羊藿苷及朝藿定A、B、C单体。

3 结 论

淫羊藿提取物样品Ⅰ中朝藿定A、B、C及淫

图4 硅胶柱分离结果的HPLC图

羊藿苷的质量比为5.95∶11.0∶24.6∶58.5，即淫羊藿苷在总黄酮中质量分数为58.5%；由此可见，结晶法可以分离淫羊藿苷单体；但是分离后的母液中淫羊藿苷的质量分数较低，只有26.2%，淫羊藿苷几乎全部溶于60%乙醇中，很难用结晶法再分离淫羊藿苷，因此利用硅胶柱法分离母液的淫羊藿混合黄酮。

100g淫羊藿提取物经D-280大孔树脂分离、结晶得到20.1g纯度为95.0%的淫羊藿苷；其母液得到29.8g淫羊藿混合黄酮。4g母液的淫羊藿混合黄酮经硅胶柱分离，得到淫羊藿苷、朝藿定A、B、C4种单体，分别为110、50、30、220mg，纯度分别为95.0%、91.0%、90.5%、93.0%。

[1] 王昌林,李星,王粤新.淫羊藿及其有效成分的药理研究概况[J].中国中药杂志,1998,23(3):55-57.

[2] 许碧连,吴铁,王晖,等.淫羊藿总黄酮药理作用的研究现状[J].中国临床药理学与治疗学,2003,8(1):115-117.

[3]XUYQ,LIZZ,YUANL,etal.VariationofepimedinsA-Candicariinintenrepresentativepopulationsofepimediumbrevicornumaxim,andimplicationsforutilization[J].ChemistryandBiodiversity, 2013, 10(4): 711-721.

[4] 张琳,张瑾.淫羊藿总黄酮的提取方法研究[J].现代中药研究与实验,2004,18(5):63-64.

[5] 雷永涛,李莉,郝小燕,等.淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺研究[J].贵阳医学院学报,2012,37(2):137-140.

[6] 郭青,吴晓燕,宁青,等.淫羊藿茎叶中5种黄酮类成分分析及质量评价[J].中草药,2011,42(10):2028-2032.

Separation of epimedium flavonoids in several epimedium extracts

WU Bo, LIU Chunying, GUO Meijuan, LI He, YU Hongshan, JIN Fengxie

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Separation methods of four kinds of monomer were studied to separate icariin epimedium extract, which included icariin, Epimedin A, B and C. The mass ratio of Epimedin A, B, C and icariin was 5.95∶11.0∶24.6∶58.5 in the raw materials. 20.1 g icariin was obtained from 100 g epimedium extract by D-280 macroporous resin column with 60% ethanol, which purity was more than 90.0%. 29.8 g mixed epimedium flavonoids was obtained from mother liquor. The mass ratio of Epimendin A, B, C and icariin was 10.8 to 18.8 to 44.3 to 26.2, indicating that icariin could not be separated by crystallization. The result showed that the product purity of icariin, Epimendin A, B, C were 95.0%, 91.0%, 90.5%, 93.0% separated by silica gel column, respectively.

epimedium flavonoids; icariin; epimendin; macroporous resin; silica gel column

2015-06-09.

“重大新药创新”科技重大专项(2012ZX09503001-003).

武 博(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

R284.2

A

1674-1404(2017)02-0089-03

武博,刘春莹,郭美娟,李鹤,鱼红闪,金凤燮.几种淫羊藿提取物中淫羊藿黄酮的分离[J].大连工业大学学报,2017,36(2):89-91.

WU Bo, LIU Chunying, GUO Meijuan, LI He, YU Hongshan, JIN Fengxie. Separation of epimedium flavonoids in several epimedium extracts[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(2): 89-91.