类风湿关节炎患者血清IL-37和可溶性PD-1分子的表达水平及临床意义①

陈栖栖 田 娟 张 晶 苏 江

(四川省医学科学院·四川省人民医院风湿免疫科，成都610072)

类风湿关节炎患者血清IL-37和可溶性PD-1分子的表达水平及临床意义①

陈栖栖 田 娟 张 晶 苏 江

(四川省医学科学院·四川省人民医院风湿免疫科，成都610072)

目的：通过研究类风湿关节炎(RA)患者血清IL-37和可溶性PD-1分子的表达水平，初步探讨其与RA的相关性以及临床意义。方法：收集RA患者及对照组人群的外周血，然后采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测30例RA患者(RA标准评分≥6)和30名健康对照组血清中IL-37、sPD-1的表达水平，结合分析两组人群外周血IL-18、IL-6和IL-18BP三种细胞因子的表达，并通过Pearson相关分析其相关性。结果：经ELISA检测发现，RA组患者外周血中IL-37和sPD-1以及其他几种炎症相关细胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6的表达水平均高于健康对照组(P<0.05)；且IL-37与细胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6均呈正相关，sPD-1仅与细胞因子IL-6呈正相关，IL-37、sPD-1均与患者病情程度评分呈正相关。结论：IL-37、sPD-1在RA患者中表达水平升高，且与其他炎性细胞因子及疾病严重程度具有相关性，两者在RA的进展中可能发挥着重要的调控作用，为今后RA治疗提供新的依据。

类风湿关节炎； 白介素-37； 可溶性PD-1； 细胞因子

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以累及周围关节为主的多系统炎症的自身免疫疾病[1]。主要临床表现为慢性、对称性。多滑膜关节炎和关节外病变，是我国最为常见的风湿病之一，患病率约为0.4%[2]。白细胞介素-37(Interleukin-37,IL-37),归属IL-1家族，属于一类抗炎性的细胞因子，其在机体自身免疫疾病中能起到保护作用，主要机制是抑制过度的炎症反应[3]。可溶性PD-1(soluble PD-1,sPD-1)是新近发现的一个协同刺激分子。研究表明可溶性协同刺激分子参与血液循环，并在免疫应答中发挥重要调节作用，目前国内对其在自身免疫性疾病中的研究较少[4]。我们通过检测和比较RA患者及健康对照人群血清中IL-37、sPD-1的表达水平，结合分析两组人群外周血IL-18、IL-6和IL-18BP三种细胞因子的表达，探讨IL-37、sPD-1与RA的相关性及其临床意义，为临床治疗RA提供新依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 RA组 依据欧洲风湿病防治联合会(EULAR)和美国风湿病学院(ACR)在2010年联合修改制定的诊断标准，即通过评估患者其得分≥6分者，即可诊断为类风湿关节炎，选取2014年1月～2015年1月在本院住院及门诊确诊的类风湿关节炎患者30例。其中男16例，女性14例，平均年龄(48.94±5.1)岁。所有患者均无系统性红斑狼疮，无感染性疾病，无急慢性疾病史。

1.1.2 对照组 随机选择在本院体检中心进行健康体检的30名健康者作为对照组，其中男性健康体检者12例，女性健康体检者18例，平均年龄(50.34±7.1)岁。且该组除无类风湿关节炎外，在研究对象的年龄、性别、其他基础疾病等方面均与RA组具有可比性，且两组在上述各方面经统计学分析，差异无统计学意义。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 病例组与对照组在采血前空腹12 h，采集外周静脉血2 ml静置半小时后采用离心机进行离心(2 000 r/min离心5 min)，离心后用抗凝素管收集上层血浆，并置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 检测方法 运用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测IL-37、sPD-1、IL-18、IL-6和IL-18BP等细胞因子表达情况，严格按照试剂盒内的说明书进行实验。直线回归方程的计算：根据标准品的浓度以及对应的A值计算出标准曲线，再用回归方程根据样品的A值，计算出对应的样品浓度。每个标本均需重复测量3次，以减少误差。仪器为ELX800酶标仪，由美国BioTech公司生产。

2 结果

2.1 两组血清IL-37和sPD-1分子的表达水平 经ELISA检测结果发现，RA组患者血清中IL-37和sPD-1的表达水平均高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。

2.2 RA相关细胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6分子的表达水平 经ELISA检测结果发现，RA组患者血清中3种炎症相关细胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6的表达水平均高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 IL-37、sPD-1与3种细胞因子相关性分析 经相关性统计分析结果发现，IL-37与细胞因子IL-18(r=0.928，P=0.004)、IL-18BP(r=0.931，P=0.002)、IL-6(r=0.851，P=0.010)均呈正相关；sPD-1仅与细胞因子IL-6呈正相关(r=0.881，P=0.010)，见表2。

2.4 RA与血清IL-37、sPD-1相关性分析 对按照ACR及EULAP联合制定的RA评分标准(表3)所获得的患者评分与RA患者血清中IL-37、sPD-1水平进行相关性分析发现，血清IL-37与患者病情程度评分呈正相关(r=0.863，P=0.004)，sPD-1与患者病情程度评分呈正相关(r=0.939，P=0.001)，见表4。

图1 两组血清IL-37分子的表达水平Fig.1 Expression of serum IL-37 in two groupsNote: Significantly different from group HC,*.P<0.05.

图2 两组血清sPD-1分子的表达水平Fig.2 Expression of serum sPD-1 in two groupsNote: Significantly different from group HC,*.P<0.05.

GroupsnIL-18(pg/ml)IL-18BP(pg/ml)IL-6(pg/ml)HCgroup3062.34±7.72210.51±24.063.60±0.31RAgroup30140.55±17.431)304.32±29.241)8.14±0.431)t15.0313.5646.90P<0.001<0.001<0.001

Note：Significantly different from group HC,1)P<0.05.

表2 IL-37、sPD-1与细胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6相关性分析

Tab.2 Correlation between IL-37,sPD-1 expression level and serum IL-8,IL-18BP,IL-6

IL-37IL-18IL-18BPIL-6sPD-1IL-18IL-18BPIL-6r0.9280.9310.8510.0620.0120.881P0.0040.0020.0100.6390.9260.010

表3 类风湿关节炎诊断评分标准

Tab.3 Diagnostic criteria for rheumatoid arthritis

ClinicalpresentationtypeStandardofthescoresInvolvedjoints0point:(1medium/largejoint);1point:(2-10medium/largejoints);2points:(1-3smalljoints);3points:(4-10smalljoints);5points:(10smalljointsabove)Serologicalindicators0point:(Anti-cycliccitrullinatedpeptideantibodyandrheumatoidfactornegative);2points:(Anti-cy-cliccitrullinatedpeptideantibodiesandrheumatoidfactordetection,oneofwhichislowpositive);3points:(Anti-cycliccitrullinatedpeptideantibodyandrheumatoidfactordetection,atleastoneofwhichishightiterpositive)Synovitisduration0point:(<6weeks);1point:(≥6weeks)Acutephasereactants0point:(ErythrocytesedimentationrateandC-reactiveproteintestresultsarenormal);1point:(ESRorC-reactiveproteinisabnormal)

表4 患者血清IL-37、sPD-1水平与RA评分相关性分析

Tab.4 Correlation between IL-13,sPD-1 expression level and RA score

IL-37sPD-1r0.8630.939P0.0040.001

3 讨论

RA是一种自身免疫系统疾病，主要病理表现为慢性血管炎和滑膜炎，严重损害患者关节腔血供，目前其病因学机制尚不明确，主要病理表现为慢性血管炎和滑膜炎[5]。RA患者滑膜组织中存在众多巨噬细胞及其分泌的IL-1、TNF-α、TNF-β等细胞因子。越来越多的研究表明这些细胞因子在RA的发生、发展过程中起到了不可或缺的作用[6-9]。IL-37是IL-1家族的新成员，具有抑制先天性炎症反应和调节免疫应答的作用[10]。IL-37在正常机体组织中的表达较少，但在发生炎症的组织中高表达，如系统性红斑狼疮患者体内IL-37表达水平较高。本次实验亦观察到RA组患者外周血中IL-37的表达水平高于健康对照组。提示IL-37同RA的发生具有一定相关性。

由于IL-37发现时间较晚，其抑制机制的研究尚处于初级阶段，但受到越来越多学者的关注，力图寻找其在自身免疫性疾病治疗中的作用。研究表明[11]，细胞因子IL-18、IL-18BP和IL-6均参与了RA的疾病进程，且IL-37与这几种细胞因子具有相关性。IL-18是IL-1家族中一类致炎性细胞因子，其在促进NK细胞活性及Th1类炎症反应中发挥着重要作用。IL-37通过与IL-18BP结合形成的复合物增强了抑制IL-18诱导生成IFN-γ的能力。IL-6在RA的发生发展进程中发挥重要作用[12,13]。本次实验发现，RA组患者外周血中IL-37以及其他几种炎症相关细胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6的表达水平均高于健康对照组；且IL-37与IL-18、IL-18BP、IL-6均呈正相关。另外，通过与RA患者疾病程度的评分的相关性研究，亦证实了IL-37与患者病情严重程度呈正相关。这与其他学者的研究结果相一致[14]。提示IL-37作为炎症抑制因子因受炎症因子刺激而代偿性增加，参与了RA的病程发展，并且IL-37与炎性相关因子之间相互影响。

虽然，目前RA的病因及发病机制尚不十分清楚，但大多数学者认为[15-17],RA是由T细胞介导的自身免疫性疾病，在RA免疫病理过程中，T淋巴细胞的过度活化起着重要作用。目前研究表明[18,19]，功能异常的T细胞介导的自身免疫损伤与RA密切相关，RA病程中T淋巴细胞的过度活化是其中一个环节。T细胞的活化需要双信号，其中第二信号需由T细胞和APC间协同刺激分子的相互作用启动。而新近发现的协同刺激分子PD-1在自身免疫反应疾病中，起到保护机体的作用，其表达可缓解促炎症T细胞在自身免疫反应疾病中的过度反应，减缓其对人体自身组织细胞的伤害。Wan等[20]研究发现，sPD-1在类风湿性关节炎患者的血清、滑膜液中的表达水平显著升高。本次研究发现，RA组患者外周血中sPD-1的表达水平高于健康对照组，且sPD-1与患者病情程度评分呈正相关，但其与IL-18、IL-18BP、IL-6三种细胞因子的相关性分析发现，除IL-6细胞因子外，均无相关性。提示sPD-1在RA的免疫病理进程中发挥了重要作用，这为进一步研究sPD-1在类风湿性关节炎病程中的作用和意义提供了实验基础。

综上所述，健康人体内IL-37、sPD-1表达较少，而在RA患者中表达水平升高，且与疾病严重程度相关。IL-37与其他炎性细胞因子IL-6、IL-18、IL-18BP具有相关性。两者在RA的进展中可能发挥着重要的调控作用。RA患者体内，炎性因子之间形成一个复杂的网络体系，作用机制亦较为复杂，通过对这些因子的检测可初步评估RA患者体内免疫功能，对预后做出判断，也为今后RA治疗提供新的依据。

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[收稿2016-08-05 修回2016-08-26]

(编辑 倪 鹏)

Expression and clinical significance of serum IL-37 and soluble PD-1 in patients with rheumatoid arthritis

CHENXi-Xi，TIANJuan，ZHANGJing，SUJiang.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu610072，China

Objective:To investigate the relationship between IL-37 and soluble PD-1 in patients with rheumatoid arthritis (RA), and investigate the relationship between IL-37 and soluble PD-1.Methods: Peripheral blood was collected from RA patients and control group.The levels of IL-37 and sPD-1 in 30 RA patients (RA standard score ≥ 6) and 30 healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The expression of IL-18, IL-6 and IL-18BP in the peripheral blood of two groups was analyzed and the correlation was analyzed by Pearson correlation analysis.Results: The results of ELISA detection showed that the expression levels of IL-37 and sPD-1 in the peripheral blood of patients with RA and other inflammatory cytokines such as IL-18, IL-18BP and IL-6 were higher than those of healthy controls (P<0.05).IL-37 was positively correlated with cytokines IL-18, IL-18BP and IL-6；sPD-1 was positively correlated with cytokine IL-6.IL-37 and sPD-1 were positively correlated with the severity of patients.Conclusion: IL-37 and sPD-1 are elevated in RA patients and associated with other inflammatory cytokines and disease severity.Both of them may play an important regulatory role in the progress of RA, and provide a new basis for future RA therapy.

Rheumatoid arthritis;Interleukin-37;Soluble PD-1;Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.022

①本文受四川省卫计委科研课题资助(No.120071)。

陈栖栖(1980年-)，女，硕士，主治医师，主要从事风湿免疫方面研究，E-mail：44475135@qq.com。

R593.22

A

1000-484X(2017)03-0422-04