禽流感病毒H5N1单克隆抗体的生物学特性鉴定①

李静丽 张海祥 冯杨萌 王光华 刘永年 胡 军

(青海大学医学院病理生理学教研组，西宁810000)

禽流感病毒H5N1单克隆抗体的生物学特性鉴定①

李静丽 张海祥②冯杨萌②王光华②刘永年 胡 军②

(青海大学医学院病理生理学教研组，西宁810000)

目的：探讨禽流感病毒单克隆抗体的生物学特性。方法：制备H5N1禽流感病毒的单克隆抗体，鉴定其亚型、效价、血凝抑制活性以及与其他亚型流感病毒的交叉反应性。免疫印迹方法验证单抗与H5N1抗原的结合，人体正常组织芯片的免疫组织化学染色法观察单抗的组织学反应。结果：发现两株禽流感病毒H5N1的单抗(H5-32和H5-35)分别与人体的肾、胰腺组织存在阳性结合。结论：禽流感病毒H5N1与人体组织间可能存在某种关联，这或许可为禽流感病毒感染和致病研究提供参考。

禽流感病毒；单克隆抗体；特性；鉴定

禽流感病毒为正黏病毒科、流感病毒属A型流感病毒，具有较强传染性，主要在禽类中传播，容易引发大面积的鸡瘟疫病，给家禽养殖业等造成极大危害。然而，上世纪末发现禽流感病毒开始能直接感染人类，并造成流行，感染者表现为结膜炎、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、脑膜炎，甚至死亡[1]。截至目前，感染人类的禽流感病毒已超过十多种[2]，其中，自2003年2月至2016年1月，高致病性禽流感病毒H5N1已造成了全球846人感染，449人死亡[3]；而仅仅2015年国内感染H7N9禽流感病毒就高达196人，死亡92人，死亡率高达47%[4]。近年来，虽然学者们提出了细胞因子风暴、补体过度激活等假说[5-7]，但对于禽流感病毒在人类中传播的致病机制目前尚不明确。因此，本实验室制备H5N1禽流感病毒的单克隆抗体，并对其生物学特性进行鉴定，以期为禽流感病毒及其传播致病研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料 H5N1、H9N2、H7N2及H3N2病毒疫苗株购自青岛易邦生物工程有限公司；甲型H1N1流感病毒裂解疫苗购自华兰生物疫苗有限公司；小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0由本实验室保存；BALB/c小鼠(8周龄,雌性)购自第四军医大学实验动物中心；HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自中杉金桥公司；聚乙二醇购自Sigma公司；mAb亚型鉴定试剂盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP为Southern Biotech公司产品；HAT购自Gibco公司；细胞培养用牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。人体正常组织芯片(包含33种器官，66个组织点)购自陕西超英生物科技有限公司，免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫及单抗的制备 将H5N1禽流感疫苗经异丁醇提取、超速离心和蔗糖梯度离心后，收集并与弗式完全佐剂乳化均匀，皮下免疫BALB/c小鼠，20～25 μg/只。3周后，加强免疫2次。融合前3 d，腹腔注射不含佐剂的抗原追加免疫。细胞融合方法参见文献[8]。采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并用有限稀释法进行克隆化，经3次克隆化后，建立稳定的杂交瘤细胞系，扩大培养并冻存。将液体石蜡腹腔注射BALB/c小鼠，1周后，腹腔接种杂交瘤细胞株制备腹水并纯化[9]。

1.2.2 单抗生物学特性分析

(1) 单抗的一般特性鉴定：包括抗体亚类的测定，采用SAB Clonotyping System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒，具体方法见说明书；单抗的血凝抑制活性通过血凝及血凝抑制(HI)试验测定。(2)单抗特异性鉴定：采用间接ELISA方法，将杂交瘤细胞诱生的小鼠腹水纯化后分别与人流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H7N2、H9N2做交叉反应鉴定，同时以Sp2/0细胞上清液为阴性对照。(3)Western blot：将H5N1禽流感病毒裂解疫苗用12%的分离胶进行SDS-PAGE后，转印至硝酸纤维素膜，以纯化的腹水作为一抗4℃孵育过夜，经PBST洗后，HRP标记的二抗室温孵育1 h，再用PBST清洗，最后经DAB显色。(4)免疫组化 将人体正常组织芯片脱蜡水化，3% H2O2处理消除组织中的内源性过氧化物酶。用pH 6.0柠檬酸缓冲液微波加热修复10 min，自然冷却。加10%的山羊血清封闭处理1 h，弃上清，不洗，直接加一抗，4℃过夜。次日取出，室温复温1 h，经PBS洗后，加入HRP标记的二抗37℃孵育1 h。经PBS洗后，DAB显色，苏木素衬染，脱水封片，镜下观察并记录。

染色结果参照Yu等[10]提出的标准进行评分，即根据每种组织细胞的着色强度及所占该类细胞的百分比划分为0～3+四个层级。每个抗体与该种组织的4次免疫组化评分结果求平均值和误差。分值0代表阴性；1+代表弱阳性：2+代表中度阳性；3+代表强阳性，因此，我们将均值在1+以上的视为抗体与该组织存在结合。

2 结果

2.1 mAb的一般特性 通过免疫小鼠H5N1禽流感病毒疫苗，获得分泌型杂交瘤细胞株，检测各杂交瘤细胞株的细胞上清中抗体效价和亚型，同时制备腹水并纯化后测定抗体效价。实验共得到39株单克隆抗体，以H5-1至H5-39表示，ELISA方法检测与其他甲型流感病毒H1N1等的交叉反应性；免疫组化方法检测单抗与人体组织反应性，其中发生明显阳性结合的抗体为H5-32、H5-35，其生物学特性见表1。

2.2 Western blot结果 抗体H5-32、H5-35与H5N1抗原进行Western blot验证，结果显示这两株抗体与H5N1抗原均有特异性反应条带，分子量大小分别在60、50 kD左右，见图1。

2.3 单抗与人体正常组织的结合情况 将本次所得的39株抗H5N1禽流感病毒的单抗分别与人体正常组织芯片做免疫组化染色实验。结果显示单抗H5-32和H5-35与人体组织间存在明显结合现象，其中抗体H5-32与肾脏组织有阳性结合；抗体H5-35与胰腺组织有结合，见图2、3。

图1 Western blot结果Fig.1 Western blot assayNote: M.Protein marker;1.mAb H5-32;2.mAb H5-35.

表1 单克隆抗体一般生物学特性

Tab.1 Biological characteristic of AIV mAbs

mAbsSubtypeHeavychainLightchainTiterSupernatantAscitesHICross-activityH5-32IgMλ103105-H1N1H5-35IgG1λ104106+-

图2 mAb与人体组织芯片的IHC结果统计图Fig.2 Statistical analysis on IHC of mAbs reaction of human tissue chip

图3 mAb与人体正常组织的IHC结果Fig.3 IHC of mAbs reaction of human tissue chipNote: A.IHC of mAb H5-32 reaction of human kidney,renal tubules were dyed light brown；B.IHC of mAb H5-35 reaction of human kidney,pancreas cells were dyed brown.

3 讨论

禽流感病毒自1878年发现以来，主要在鸟类、水禽、家禽以及犬、马、猪等物种传播，引发的各种疫病给人民群众造成了巨大的经济损失。目前禽流感病毒已经识别出18种HA和11种NA亚型[11]，据报道其中禽流感病毒H5N1、H7N9、H9N2等亚型已经传播到人类[12]，导致人类角膜炎、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭，甚至死亡，其危害十分严重。

本实验室制备禽流感病毒H5N1的单克隆抗体，对其生物学特性进行鉴定研究。结果发现，单抗H5-32为IgM亚类，无血凝抑制活性，与H5N1病毒在60 kD左右有特异性反应条带，同时又与H1N1病毒之间存在交叉反应，由于多糖类抗原易引发IgM类抗体，说明该单抗可能是抗病毒核蛋白上的多糖成分，虽然其免疫保护作用不强，但可以作为H1N1和H5N1的通用型抗体使用；单抗H5-35为IgG1亚类，具有血凝抑制活性，与H5N1病毒在56 kD左右有特异性反应条带，同时该单抗与其他流感病毒间不存在交叉反应，说明该抗体抗病毒血凝素，且其免疫原性和免疫保护作用均较好，可以用于H5N1禽流感病毒检测试剂盒的制备，及其流行的监测和疫苗研究等。

此外，两株单抗分别与人体肾组织和胰腺组织存在阳性结合，这与以往禽流感病毒死亡病例的尸检报道基本一致，感染禽流感患者除发生肺脏损伤外，也出现了心肌水肿、肾充血水肿、急性肾小管坏死等器官组织损伤现象[13,14]，提示我们H5N1禽流感病毒和人体组织间可能存在某种关联。

目前，学者普遍认为，禽流感病毒在人类机体中的致病过程大致与以下现象有关：细胞因子风暴，即病毒感染会导致IL-1、IP-10、IL-6、TNF、IFN-γ、MCP-1等细胞因子显著增高[5,6,15]；补体的过度激活，即C3、C5b-9和甘露结合凝集素(MBL)-C在肺组上的沉积以及MBL介导的丝氨酸蛋白酶-2和C3aR、C5aR的补体受体上调[7,16,17]。另外，Ahmed等证实流感病毒H1N1核蛋白上存在与人下丘脑泌素受体2细胞外区肽段结构相似的表位，使患者机体内产生相应的抗下丘脑泌素受体 2 的抗体并干扰下丘脑泌素的信号转导，最终诱生发作性嗜睡病[18]；Guo等[19]也发现H1N1的HA可能与人体组织脑、胰腺存在相似性抗原表位。这些均说明禽流感病毒致病的罪魁祸首有可能并非病毒本身，而是禽流感病毒劫持患者机体的自身免疫系统，其过度应答造成细胞因子风暴或补体的异常，使机体组织器官受到损伤进而致病、致死[20]。

总之，实验发现禽流感病毒H5N1的单抗与人体组织存在阳性结合，说明两者之间可能具有相似性抗原表位，从而劫持患者自身免疫系统导致机体损伤，这或许是禽流感病毒致病的可能原因之一。该抗体的获得为H5N1禽流感病毒的检测和流行监测提供实验材料，也为禽流感病毒致病机理和相关疫苗的研究提供实验基础。

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[收稿2016-10-08 修回2016-11-07]

(编辑 张晓舟)

Identification on biological characteristics of AIV H5N1 monoclonal antibody

LIJing-Li,ZHANGHai-Xiang,FENGYang-Meng,WANGGuang-Hua,LIUYong-Nian,HUJun.

DepartmentofPathophysiology,MedicalCollege,QinghaiUniversity,Xining810000,China

Objective:To investigate the biological characteristics of monoclonal antibodies against avian influenza virus (AIV).Methods: Monoclonal antibodies (mAbs) against AIV H5N1 were prepared and it′s characteristics were identified including subtype,titer,hemagglutination inhibition activity and cross-reactivity with other influenza viruses.Besides,Western blot and immunohistochemical staining methods were conducted to test the combination of antibodies and antigen (H5N1) and human normal tissues.Results: Immunohistochemical analysis showed that 2 mAbs (H5-32 and H5-35) cross-reacted with human tissues kidney and pancreas respectively.Conclusion: These data indicated that there have some association between the AIV H5N1 with human tissues,which may provide reference for the study on avian influenza virus infection and pathogenicity.

Avian influenza virus;Monoclonal antibody;Characteristic;Identification

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.017

①本文受“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项(No.2014ZX10004002)和国家重点研发计划项目“畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发”重点专项(No.2016 YFD0500700)资助。

李静丽(1990年- )，女，在读硕士，主要从事免疫学与药理学方面的研究。

及指导教师：刘永年(1959年-),男,教授，硕士生导师，主要从事高原病发病机制与预防方面的研究，E-mail: liuyongnian@qhu.edu.cn。 胡 军(1962年-),男,博士，研究员,硕士生导师，主要从事微生物与免疫学研究，E-mail: hjj6562@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2017)03-0398-04

②陕西省人民医院中心实验室，西安710068。