奥沙利铂调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用研究①

段友强 刘义锋 李 巍

(郑州大学附属郑州中心医院神经外科，郑州450007)

·基础免疫学·

奥沙利铂调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用研究①

段友强 刘义锋②李 巍③

(郑州大学附属郑州中心医院神经外科，郑州450007)

目的：研究奥沙利铂(Oxaliplatin,Ox)调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用。方法：培养U87脑胶质瘤细胞，分别利用0、20、40、80 μg/ml的奥沙利铂处理U87细胞24、36、48、72 h，利用MTT检测各处理组细胞增殖情况；利用流式细胞仪检测40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h对U87细胞周期及细胞凋亡的影响；Western blot检测40 μg/ml 的奥沙利铂处理48 h对U87细胞凋亡相关蛋白及PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响。结果：奥沙利铂处理抑制U87细胞增殖，与0 μmol/L处理相比，差异显著(P<0.01)，40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h差异最显著。40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h后，U87细胞周期被阻滞在S期，U87细胞凋亡显著增加(P<0.01)，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表达明显下降，促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达明显升高(P<0.01)，PI3K及p-Akt的表达量明显降低(P<0.01)，Akt表达量无明显差异(P>0.05)。结论：奥沙利铂可能通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制U87细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡。

奥沙利铂；脑胶质瘤细胞；增殖；细胞周期；凋亡

脑胶质瘤常发于神经外胚层，是神经系统常发恶性肿瘤，发病率约占颅内肿瘤的45%[1]。目前对胶质瘤的治疗仍以手术为主，但是由于胶质瘤具有浸润性生长的特点，手术并不能完全切除癌变组织，手术后极易复发，致死率极高[2，3]，因此迫切的需要寻找新的胶质瘤治疗手段。奥沙利铂是第三代铂类抗癌药物，具有极好的抗肿瘤效果，药物对正常细胞的毒副作用较小，与顺铂、卡铂之间无交叉耐药的出现[4]。奥沙利铂在结肠癌[5]、乳腺癌[6]、非小细胞肺癌[7]、胃癌[8]等癌症的治疗中取得了较好的效果，但是关于奥沙利铂作用于胶质瘤的相关研究还较少。本研究通过体外培养脑胶质瘤细胞株U87，并使用奥沙利铂处理，探究了奥沙利铂对U87细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响，并探讨了可能存在的作用机制，以期为脑胶质瘤的治疗提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料 胶质瘤U87细胞系由中国科学院细胞库提供；奥沙利铂购自山东铂源药业有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基购自美国Hyclone；蛋白酶裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；Bax单抗、Bcl-2单抗、Cleaved-caspase3单抗、PI3K单抗、Akt单抗、p-Akt单抗购自美国CTS；蛋白提取试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；MTT试剂盒购自美国Roche；酶标仪、流式细胞仪购自美国Thermo。

1.2 方法

1.2.1 U87细胞培养 取冻存的脑胶质瘤U87细胞株，置于37℃恒温水浴锅解冻，解冻完全后离心收集细胞，将细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，细胞放于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至约铺满培养皿底80%时取出，弃去细胞培养液，使用PBS缓冲液冲洗细胞2次，向细胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化2～3 min，待大部分细胞脱离皿底时，向细胞中加入DMEM细胞培养液终止消化，细胞转移至离心管中离心收集沉淀，向沉淀中加入DMEM培养液重悬细胞，重悬后细胞接种至新的含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中继续培养。

1.2.2 四氮唑蓝测定细胞增殖 取对数生长期的U87细胞，弃去细胞培养液，经PBS缓冲液清洗后，加入0.25%胰酶消化，消化完全后将细胞转移至离心管中，1 000 r/min离心10 min取沉淀，向细胞沉淀中加入培养液后重悬，显微镜下计数并调整细胞浓度为5×106个/ml，按每孔200 μl的量将细胞悬液接种于96孔板中，将细胞置于细胞培养箱中培养24 h。培养结束后弃去旧培养液，向细胞中分别加入含奥沙利铂浓度为0、20、40、80 μg/ml的新鲜细胞培养液，并设置空白对照组，空白对照组不加细胞，置于细胞培养箱中继续培养24、36、48、72 h，培养结束前4 h向每孔细胞中加入20 μl MTT，置于培养箱中继续培养直至结束，向每孔细胞中加入200 μl DMSO，混匀后置于酶标仪中检测490nm处吸光度，并分析细胞的增殖情况。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.2.3 流式细胞仪PI单染色法检测细胞周期将U87细胞接种于6孔板中，细胞生长至对数期后，加入40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h，另取不做处理的细胞作为对照，胰酶消化各组细胞后，离心收集细胞沉淀，PBS重悬细胞并调整细胞浓度为5×105个/ml，取1 ml细胞，向细胞中加入3 ml预冷的75%的乙醇4℃过夜，PBS清洗2次，加入500 μl含50 mg/L RNaseA及10 μg/ml PI的PBS缓冲液，室温避光孵育30 min后，利用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。

1.2.4 流式细胞仪测定细胞凋亡 将U87细胞接种于6孔板中，待细胞生长至对数期，向细胞中加入终浓度为40 μg/ml的奥沙利铂处理细胞48 h，另取不做处理的细胞作为对照，胰酶消化各组细胞，离心收集细胞沉淀，PBS重悬细胞并调整细胞浓度为5×105个/ml，取1 ml细胞，向细胞中加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温避光孵育15 min后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot检测细胞中相关蛋白表达 取对数生长期的经40 μg/ml奥沙利铂处理48 h的U87细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀，向沉淀中加入细胞裂解液后置于冰上孵育30 min，4℃，12 000 r/min离心20 min，上清转移至新的离心管中，采用BCA试剂盒检测所提取蛋白浓度。向提取的蛋白中加入Loading Buffer，100℃煮沸5 min制备蛋白样品。配置蛋白胶，蛋白胶凝固后上样，保证每孔蛋白上样量一致，80 V电泳30 min后，换用120 V电压继续电泳，直至溴酚蓝跑出玻璃板。冰浴100 V转膜，5%脱脂奶粉室温孵育PVDF膜6 h，分别以Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、PI3K、Akt、p-Akt单克隆抗体作为一抗，4℃过夜孵育，TBST清洗3次，加入二抗置于37℃孵育1 h，TBST清洗3次，加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。

2 结果

2.1 奥沙利铂抑制U87细胞增殖 分别使用0、20、40、80 μg/ml的奥沙利铂处理对数期的U87细胞24、36、48、72 h后，利用MTT检测各组细胞存活情况，并进行统计，结果如图1所示，奥沙利铂处理对U87细胞的存活具有抑制作用，且具有浓度时间依赖性，U87细胞存活率随着奥沙利铂处理时间的增长、处理浓度的增高而降低，与0 μg/ml处理相比，差异显著(P<0.01)。40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h对U87细胞存活的抑制作用最明显。

2.2 奥沙利铂对U87细胞周期的影响 利用流式细胞仪检测40 μg/ml奥沙利铂处理48 h对U87细胞周期的影响，结果如表1所示，奥沙利铂处理后，G0/G1期和G2/M期细胞减少，S期细胞增多，与 0 μg/ml奥沙利铂处理相比，差异显著(P<0.05)，40 μg/ml奥沙利铂处理诱导U87细胞被阻滞在S期。

2.3 奥沙利铂促进U87细胞凋亡 40 μg/ml奥沙利铂处理U87细胞48 h后，利用流式细胞仪检测U87细胞凋亡情况，并进行统计，结果如图2所示，40 μg/ml奥沙利铂处理后，U87细胞凋亡明显增多，与0 μg/ml处理相比差异具有显著统计学意义(P<0.01)。

图1 奥沙利铂处理对U87细胞存活的影响Fig.1 Effect of oxaliplatin treatment on U87 cell survivalNote: **.P<0.01.

GroupsG0/G1phase(%)Sphase(%)G2/Mphase(%)0μg/mloxaliplatin39.40±1.2447.25±2.2013.35±2.5340μg/mloxaliplatin32.75±2.391)56.53±3.501)10.72±1.051)

Note：Compared with 0 μg/ml oxaliplatin group,1)P<0.05.

图2 奥沙利铂处理对U87细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of oxaliplatin treatment on U87 cell apoptosisNote: A.Flow cytometry detected U87 cell apoptosis；B.U87 cell apoptosis rate,**.P<0.01.

2.4 奥沙利铂对Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达的影响 收集经40 μg/ml奥沙利铂处理48 h后处于对数期的U87细胞，提取细胞总蛋白，Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3的表达，结果如图3所示，40 μg/ml奥沙利铂处理后，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表达量降低，促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达量升高，与0 μg/ml处理相比具有显著性差异(P<0.01)。

图3 奥沙利铂处理对U87细胞凋亡蛋白表达影响Fig.3 Effect of oxaliplatin on expression of apoptotic protein in U87 cellsNote: A.Western blot detected the protein expression rate；B.The protein relative expression rate,**.P<0.01.

图4 奥沙利铂处理对PI3K/Akt通路关键蛋白表达影响Fig.4 Effect of oxaliplatin treatment on protein expression in PI3K/Akt pathwayNote: A.Western blot detected the protein expression rate；B.The protein relative expression rate,**.P<0.01.

2.5 奥沙利铂对PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响 Western blot检测40 μg/ml奥沙利铂处理48 h对PI3K/Akt通路蛋白表达的影响，结果如图4所示，与0 μg/ml处理相比，40 μg/ml奥沙利铂处理后，PI3K及p-Akt的表达量明显降低(P<0.01)，Akt表达量无明显差异(P>0.05)。

3 讨论

脑胶质瘤是常发于人颅内的一种原发性肿瘤，是颅内发病率以及致死率最高的恶性肿瘤。传统的脑胶质瘤治疗手段是手术切除为主，辅以放疗、化疗、生物治疗等多种治疗方法。由于脑胶质瘤的恶性程度极高，在颅内呈浸润性生长，与正常脑组织的界限很不明显，手术难以完全切除癌变组织，因此术后脑胶质瘤的复发率极高。

奥沙利铂是继顺铂和卡铂之后开发的第三代铂类金属抗肿瘤药物，属于DNA烷化剂。奥沙利铂不仅具有很高的抗癌活性，而且对顺铂耐药的细胞也具有抑制作用。研究发现，奥沙利铂进入到细胞内，通过与DNA结合形成铂类-DNA复合物，引起DNA的损伤，进而引起细胞凋亡；引起肿瘤细胞凋亡是铂类抗肿瘤药物发挥作用的主要方式[9]。为了探究奥沙利铂对脑胶质瘤细胞的作用，分别使用0、20、40、80 μg/ml的奥沙利铂处理U87细胞24、36、48、72 h，检测U87细胞的存活情况，结果发现，奥沙利铂能显著抑制胶质瘤细胞的存活，且呈浓度时间依赖性，其中40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h对U87细胞存活的抑制作用最明显。胶质瘤的发生发展过程十分复杂，除了与细胞活性的升高有关之外，与细胞周期调控的失常也具有密切的关系。细胞周期进程中，细胞周期蛋白通过与相关的激酶结合调控细胞周期进程[10]。肿瘤药物通常将肿瘤细胞周期阻滞在G1/S或G2/M期，从而修复受损的DNA[11]。本研究利用40 μg/ml奥沙利铂处理U87细胞48 h，流式细胞仪检测细胞周期的分布情况，结果显示，奥利沙铂处理后，处于G0/G1期和G2/M期细胞减少，S期细胞增多，说明奥利沙铂处理诱导U87细胞被阻滞在S期。Bcl-2和Bax属于Bcl-2家族，Bcl-2家族在细胞凋亡过程中具有重要的作用[12]。Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax对细胞凋亡具有促进作用，二者在细胞中常以同源或异源二聚体形式存在[13]。当细胞内Bcl-2含量增多时，Bcl-2/Bax二聚体含量增多，凋亡受到抑制，当Bax含量增加时，Bax自身形成同源二聚体，促进细胞凋亡[14]。caspase家族在细胞凋亡过程中具有重要作用。caspase3位于caspase级联反应的下游，是caspase凋亡依赖途径的交汇点，caspase3的活化对细胞凋亡具有促进作用[15]。流式细胞仪检测结果显示，40 μg/ml奥沙利铂处理U87细胞48 h显著促进U87细胞凋亡，Western blot检测结果发现，奥沙利铂处理后，Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达明显升高，证实奥沙利铂通过调控凋亡相关蛋白的表达促进U87细胞凋亡。

PI3K/Akt信号通路在细胞中广泛存在，对细胞的增殖、分化、凋亡及细胞周期进程具有调控作用[16]。有研究证实，PI3K/Akt通路的活化促进癌细胞增殖，抑制凋亡的发生[17]。研究PI3K/Akt对细胞凋亡的调控，发现活化的Akt通过磷酸化Bcl家族成员BAD，阻断BAD/Bcl-2复合体的形成，直接调控细胞凋亡[18]，也可以通过磷酸化NF-κB，促进NF-κB转录，进而促进Bcl-xl的表达，促进细胞存活[19]，Akt还可通过磷酸化mTOR参与细胞周期进程[20]。本研究利用Western blot检测奥利沙铂处理对PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响，结果显示，奥沙利铂处理后，PI3K及p-Akt的表达量明显降低，Akt表达量无明显差异，证实奥利沙铂对PI3K/Akt信号通路具有抑制作用。奥沙利铂处理可以显著抑制U87细胞增殖，阻滞细胞周期进程，促进细胞凋亡，作用机制可能与PI3K/Akt信号通路的抑制有关，为临床上奥沙利铂治疗脑胶质瘤提供了新的研究思路。

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[收稿2016-09-26 修回2016-11-08]

(编辑 倪 鹏)

Research of oxaliplatin inhibit growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/Akt signal pathway

DUANYou-Qiang,LIUYi-Feng,LIWei.

DepartmentofNeurosurgery,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007,China

Objective:To investigate the effect of oxaliplatin inhibit the growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/Akt signal pathway.Methods: The glioma U87 cells were cultivated in vitro,using 0,20,40,80 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 24,36,48,72 h respectively,MTT was used to detect cell proliferation.Using 40 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 48 h,flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.Cells apoptosis protein and PI3K/Akt pathway protein expression after 40 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 48 h was detected by Western blot.Results: MTT assay showed that compared with the 0 μg/ml treatment,oxaliplatin treatment could significantly inhibited U87 cell survival (P<0.01),40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h ,the survival inhibitory was the most obvious.U87 cell cycle was arrested in S phase after 40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h.After 40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h,compared with the 0 μg/ml treatment,U87 cell apoptosis rate significantly increased (P<0.01).Western blot showed that after 40 μg/ml oxaliplatin treatment,anti-apoptotic factor Bcl-2 expression had significant decreased,pro-apoptotic factors Bax,Cleaved-caspase3 protein expression had significantly increased (P<0.01).PI3K,p-Akt expression was significantly decreased (P<0.01),and Akt expression had no significant change in Akt pathway (P>0.05).Conclusion: Oxaliplatin may suppress U87 cell proliferation,arrest cell cycle,and promote apoptosis by inhibit PI3K/Akt signaling pathway.

Oxaliplatin; Glioma cells; Proliferation; Cell cycle; Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.002

①本文为国家自然科学基金项目(No.81401097)。

段友强(1967年-)，男，硕士，主治医师，主要从事神经外科方面的研究，E-mail：youqiangduan6705@163.com。

R739.4

A

1000-484X(2017)03-0328-05

②郑州大学附属南阳中心医院神经内科，南阳473000。

③沈阳军区总医院神经内科，沈阳110000。