高效液相色谱法测定阳和膏中双酯型生物碱限量

叶锦雄，罗嘉琪，翟文泽

（1．广东省广州市东升医院药剂科，广东 广州 510140； 2．广东药学院中药学院·国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室·广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006）

·检验检测·

高效液相色谱法测定阳和膏中双酯型生物碱限量

叶锦雄1，罗嘉琪2，翟文泽2

（1．广东省广州市东升医院药剂科，广东 广州 510140； 2．广东药学院中药学院·国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室·广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006）

目的建立测定阳和膏3种双酯型生物碱限量的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱采用Inertsil ODS-3柱（250 mm×4．6mm，5 m）；流动相为乙腈-四氢呋喃（25∶15）及以0．1mol／L醋酸铵溶液（每1000mL加冰醋酸0．5mL），梯度洗脱；体积流量为1．0mL／min；柱温为20℃；检测波长为235 nm。结果新乌头碱、次乌头碱和乌头碱分别在0．214 8～2．148 0 g，0．196 8～1．968 0 g，0．204 0～2．040 0 g范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率分别为93．24%，98．49%，94．93%，RSD分别为2．12%，2．51%，2．65%(n＝6)。结论该方法可靠，重复性好，可用于阳和膏的质量控制。

阳和膏；双酯型生物碱；高效液相色谱法

阳和解凝膏来源于清代王维德《外科证治全生集》，在此方剂基础上经我院名中医药专家多年的摸索并改良而得阳和膏。阳和膏具有温经和阳、散结消肿等功效，用于阴疽流注、冻疮、肿毒等属阴证者，临床上用于治疗骨髓炎和乳腺增生[1]。该制剂由制川乌、制草乌、淡附片、牛蒡子、地龙、当归、肉桂、白芷、乳香、没药、赤芍、大黄等中药组方。原标准中只有质量差异和软化点测定，不能较好地控制其质量。乌头类中药为处方中的主药，其中乌头类生物碱具有抗炎止痛[2-3]和抑制肿瘤生长[4]的作用，同时也有较强的毒性[5-8]，为了能更好地控制阳和膏的质量，参考文献[9]，本研究中对该制剂中的双酯型生物碱进行高效液相色谱（HPLC）法限量测定，以期建立稳定、可行的质量控制方法。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Waterse2695型高效液相色谱仪，包括四元低压梯度泵，Waters2998PDA检测器，Empower3色谱管理系统（美国Waters公司）；AUW120D型电子天平（日本岛津公司）。

1．2 试药

乙腈、四氢呋喃为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；新乌头碱对照品（批号为150228），次乌头碱对照品（批号为 141105），乌头碱对照品（批号为141102)，均由广州市齐云生物科技有限公司提供；阳和膏（医院制剂室，粤药制字Z20071509）。

2 方法与结果

2．1 色谱条件[10]与系统适用性试验

色谱柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；柱温：20℃；流动相：乙腈-四氢呋喃（25∶15，A），0．1mol／L醋酸铵溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长：235 nm；流速 1．0 m L／min。在此色谱条件下，各组分分离良好，阴性对照无干扰，详见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2．2 溶液制备

混合对照品溶液：取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1m L含新乌头碱0．107 4mg，次乌头碱0．098 4mg，乌头碱0．102 0mg的混合溶液，即得。

图1 高效液相色谱图

供试品溶液：取本品4张，4℃冷藏后对折剪碎，再置-20℃下冷冻，取出，除去盖衬，置锥形瓶中，加入3 mol／L硫酸 100 m L，振摇 5 min，放置过夜。加乙醚30m L，转移至布氏漏斗中减压抽滤，用乙醚洗涤容器和滤渣2次，每次10m L，洗液分次转移至布氏漏斗中减压抽滤至无水滴时，弃去漏斗中的乙醚液。再用3mol／L硫酸溶液分次洗涤容器和滤渣，每次20mL，洗液分次转移至布氏漏斗中减压抽滤，滤液合并，再转移至分液漏斗中，用3mol／L硫酸溶液洗涤容器2次，每次10m L，洗液并入同一分液漏斗中，用乙醚洗涤2次，每次10mL，弃去乙醚液。水层用氨水调节pH至9～10，再用乙醚振摇提取6次，每次120 mL，合并乙醚液，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液使溶解，转移至2m L容量瓶中，加异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取处方缺制川乌、制草乌、附片的其他药味，照处方生产工艺制备阴性样品，依法制得阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取上述对照品溶液各0．02， 0．05，0．10，0．15，0．20mL，分别置2mL容量瓶中，加异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液稀释至刻度，摇匀，制成5种浓度的对照品溶液。分别精密吸取以上对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定。以进样量（X，μg）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，新乌头碱 Y＝1．3 E+6X-34 954，r＝1．000 0；次乌头碱 Y＝1．5 E+ 6X-38412，r＝0．9998；乌头碱 Y＝1．2E+6X+1603．3，r＝0．999 8。结果表明，新乌头碱、次乌头碱和乌头碱进样量分别在 0．214 8～2．148 0，0．196 8～1．968 0，0．204 0～2．040 0μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取新乌头碱、次乌头碱和乌头碱混合对照品溶液各20μL，按拟订色谱条件进样测定6次。结果新乌头碱、次乌头碱和乌头碱峰面积积分值的 RSD分别为0．72%，0．81%，1．38%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为140101）样品，依法制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样20μL，测定。结果供试品溶液均未检出新乌头碱、次乌头碱和乌头碱，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取新配制的新乌头碱、次乌头碱和乌头碱混合对照品溶液20μL，按拟订色谱条件，分别于0，2，4，8，12 h时进样测定新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的峰面积。结果新乌头碱、次乌头碱和乌头碱峰面积的RSD分别为1．42%，2．86%，1．63%（n＝5），表明新乌头碱、次乌头碱和乌头碱混合对照品溶液在12 h内稳定性良好。

回收试验：精密称取新乌头碱、次乌头碱和乌头碱对照品适量，加异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成新乌头碱、次乌头碱和乌头碱混合对照品溶液。取同一供试品（批号为140101）共6份，分别精密加入上述新乌头碱、次乌头碱和乌头碱混合对照品溶液1m L，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别进样20μL，测定。结果见表2。

2．4 样品限量测定

取阳和膏3批（批号为131201，140101，140102），依法制备3个不同批次样品的供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样20μL，测定。结果双酯型生物碱以新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的总量计，均未检出。

2．5 检出限

取已制备好的双酯型生物碱对照品，其中新乌头碱0．002 148 g／L，次乌头碱0．001 968 g／L，乌头碱0．002 040 g／L，分别进样5μL测定，检出限设为信噪比为2～3∶1，确定新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的检测限分别为0．010 74，0．010 2，0．009 84μg。

表2 回收试验结果(n＝6)

3 讨论

膏药遵循中医辨证论治及中药的功效、主治原则，充分调动药物相互作用的效能，多由多味药物组方，以发挥药物的良好效果。膏药直接敷贴于体表，药物通过渗入皮肤，内传经络、脏腑，起到通经络、调气血、祛寒湿、散瘀、消肿止痛等作用。由于黑膏药的制作工艺较复杂，基质处方往往要根据天气的冷暖来调整，以避免成品太硬或太软等问题，且成品黏度较大，辅料的量较大，不易进行质量分析。

阳和膏主要由中药饮片、花生油与红丹（铅丹）炼制而成。本试验中，发现牛皮纸对回收率有明显影响，且牛皮纸具有一定的体积，需增加提取溶剂的用量，不利于试验，但经低温冷冻后，牛皮纸与制剂较易剥离，制剂变碎，可较好地去除牛皮纸衬盖，避免牛皮纸对测定的影响。

考察了三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚和盐酸等[11-15]提取溶剂，虽可溶解样品，但较难将基质完全除去，同时也存在阴性对照干扰或提取不完全等问题。本试验以不同浓度硫酸溶液进行提取，分别考察了0．05，0．10，0．20，0．50，1．50，2．00，2．50，3．00 mol／L的硫酸溶液，结果显示硫酸溶液浓度达到3mol／L能较好地溶解样品，且对双酯型生物碱的影响较小，达到较高提取效率，故选择3mol／L硫酸作为提取溶剂。采用硫酸溶液冷浸的方式对样品进行处理，不仅能避免双酯型乌头碱加热分解，实现制剂基质与被检物质的分离，提高提取效率，减少有机溶剂的使用量，利于环境保护。

处方中制川乌、制草乌和淡附片均含有苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱，故考察同时缺制川乌、制草乌和淡附片的阴性样品。

综上所述，本方法结果准确，重复性好，可用于阳和膏的限量测定。由于生产工艺温度较高，可达320℃，乌头碱类成分可能已被破坏，故本试验中3批样品均未检出乌头碱类成分，在日常检验工作中，发现部分样品可检出双酯型乌头碱，含量均不超过每张3μg，远低于标准中不超过80μg含量的要求。出于制剂安全性的考察，本研究仍具有重要意义。

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Lim it Detection of Douber-Ester A lkaloids from Yanghe Plaster by HPLC

Ye Jinxiong1,Luo Jiaqi2,Zhai Wenze2
(1．Guangzhou Dongsheng Hospital,Guangzhou,Guangdong,China 510140; 2．Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong,China 510006)

Objective To establish an HPLC limit detection method for douber-ester alkaloids in Yanghe plaster．M ethods The separation was performed on Inertsil ODS-3 column(250 mm×4．6 mm,5μm)．The mobile phase were acetonitrile-tetrahydrofuran(25∶15) and 0．1 mol／L ammonium acetate-water with gradient elution．The flow rate was 1 m L／min with column temperature 20℃ and detection wavelength at 235 nm．Resu lts The calibration curves were within the ranges of 0．214 8-2．148 0μg for hypaconitine,0．196 8～1．968 0μg for mesacontitine and 0．204 0-2．040 0μg for aconitine．The average recoveries were 93．24%,98．49% and 94．93%, RSD were 2．12%,2．51% and 2．65%(n＝6),respectively．Conclusion This method is reliable,reproducible,which can be applied to quantitative analysis of this preparation．

Yanghe Plaster;douber-ester alkaloids;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2017)03-0022-03

2016-10-18；

2016-11-24)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．007

叶锦雄（1977-），男，硕士研究生，副主任中药师，研究方向为医院制剂和临床药学，（电话）020-81911115-8901（电子信箱）yaehi＠126．com。