回医扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠肿瘤坏死因子-α和内皮素-1表达的影响

刘 超 刘敬霞 黑常春 刘抒雯 甘佳乐 顾玉宝 王 枫

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

·基础研究·

回医扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠肿瘤坏死因子-α和内皮素-1表达的影响

刘 超 刘敬霞 黑常春 刘抒雯 甘佳乐 顾玉宝 王 枫

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

目的 探讨扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑内肿瘤坏死因子(TNF)-α和内皮素(ET)-1表达的影响。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、扎里奴思方组，每组15只。除假手术组外，其余各组均给予高脂喂养4 w后，再给予10%的自体粪便1 ml/100 g灌胃，1次/d，连续3 d，造成痰热腑实证模型；再采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)。大鼠给药剂量为尼莫地平组10.8 mg/kg、扎里奴思方组1.54 g/0.1 kg，制备MCAO模型前3 d灌胃给药。大鼠分别于缺血再灌注后1、3、7 d取脑；取材前进行脑组织含水量测定，采用免疫组化法检测脑缺血侧海马区TNF-α、ET-1表达，RT-PCR检测TNF-α mRNA和ET-1 mRNA的表达。结果 与假手术组比较，模型组脑组织含水量增高(P<0.01)、TNF-α、ET-1阳性细胞和TNF-α mRNA、ET-1 mRNA表达明显增高(P<0.01)；与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方组脑组织含水量降低、TNF-α、ET-1阳性细胞数减少，TNF-α mRNA、ET-1 mRNA表达降低(P<0.01)。与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组脑组织含水量降低、TNF-α、ET-1阳性细胞数减少和TNF-α mRNA、ET-1 mRNA表达降低(P<0.05)。结论 扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑神经元起保护作用，其机制可能与抑制大鼠脑内TNF-α和ET-1的表达有关。

扎里奴思方；脑缺血再灌注；痰热腑实证；肿瘤坏死因子(TNF)-α；内皮素(ET)-1

缺血性脑血管疾病(ICVD)发病率高、死亡率高、复发率高、致残率高等特点〔1〕。在该病的发生中炎症反应促进了脑缺血损伤的发展，是脑和神经损伤的主要病理机制之一〔2〕。肿瘤坏死因子(TNF)-α是炎症反应的始动因子，在脑缺血再灌注早期，TNF-α的合成和释放增加是促进脑梗死形成的重要原因〔3〕。内皮素(ET)-1参与脑缺血、脑水肿的病理生理过程，可增加脑组织内水、钠含量，从而促进缺血性脑水肿的发生、发展〔4〕，引起血管强烈收缩导致神经元缺血、坏死，并可促使炎性因子过度表达。《回回药方》中扎里奴思方具有芳香开窍、补肾益髓、化痰祛瘀之功，对缺血再灌注大鼠具有调控血脑屏障、抗脑缺血损伤和保护神经元等作用〔5〕。本研究拟探讨扎里奴思方对脑缺血后神经元的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，3～4月龄，体重(300±50)g，宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(宁)2014-0001。饲养于宁夏医科大学实验动物中心，温度(25±1)℃，湿度(50±10)%，自由觅食饮水，适应性饲养7 d后进行实验。

1.2 药物

1.2.1 扎里奴思方 组成：海狗肾(腽肭脐)12 g、肉桂(萨底知)12 g、菟丝子(阿夫忒蒙)12 g、石菖蒲(哈咱卜咱里刺)12 g、安息香(阿你松)3 g、小茴香(法理公)12 g、乳香(兀沙吉)12 g、当归(法忒刺撒里荣)12 g、没药(木里叶)12 g、怀牛膝(干祖伐)24 g、番红花(撒法郎)12 g、芦荟(拆不牙刺)12 g、牡丹皮12 g、水龙骨(伯思八牙)12 g。由宁夏医科大学附属回医中医院提供制备。

1.2.2 尼莫地平片 规格30 mg/片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司。将尼莫地平研磨成细小的粉末状，加入适量的生理盐水混匀(1.08 mg/ml)灌胃。

1.2.3 高脂饲料〔6〕3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.12%丙硫氧嘧啶、2%吐温-80、10%猪油、84.38%基础饲料。

1.3 主要试剂和仪器 蒸馏水(宁夏医科大学实验动物中心)；胆固醇(郑州兴昌化工产品有限公司，批号：57784)；1，2-丙二醇(重庆博洋生物技术有限公司，批号：57854)；吐温-80(重庆博洋生物技术有限公司)；猪油(超市购买)；TaKaRa RNA PCR试剂盒(TaKaRa公司)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；局灶性脑缺血(MCAO)A4尼龙栓线(重庆博洋生物技术有限公司，批号：2832-A4)；多聚甲醛(重庆博洋生物技术有限公司)；兔二抗及二氨基联苯胺(DAB)显色剂；电子天平(BT224S，Sartorius公司)。

1.4 分组与用药 将60只雄性大鼠按随机数字表法分为假手术组，模型组(痰热腑实证脑缺血组)，尼莫地平组，扎里奴思方组，15只/组。除假手术组外，其他各组均给予高脂饲料喂养4 w后，再予自体粪便3 d后，每组随机抽选3只大鼠，腹主动脉采血，检测血脂，若血脂异常为痰热腑实模型造模成功，然后模型MCAO制备〔7〕。假手术组、模型组给予生理盐水灌胃，药物治疗组分别用相应药物灌胃。大鼠灌胃用药量根据生药材含量按等效剂量换算关系计算，灌胃体积为1 ml/100 g，扎里奴思方为1.54 g/ml；尼莫地平1.08 g/L。大鼠术后每日用药1次，均于术前12 h禁食不禁水。

1.5 脑组织含水量测定 各组大鼠断头取左侧缺血脑组织。首先用电子天平称湿重，然后将脑组织放入恒温烤箱内烘干至恒重，称取干重。根据Elliot公式来计算，脑含水量%=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6 免疫组织化学法检测TNF-α和ET-1表达 采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学染色法检测TNF-α和ET-1在缺血海马区的蛋白表达情况，按照试剂盒提供的实验步骤操作：对各组大鼠按规定时间灌注后取脑，石蜡包埋脱水，3%H2O2室温10 min以灭活内源性酶；微波炉加热至沸腾，热修复抗原；滴加封闭液，室温30 min；滴加1∶100工作浓度的一抗，4℃过夜；滴加生物素化二抗，37℃孵育30 min；滴加试剂SABC，37℃孵育30 min；DAB显色；蒸馏水冲洗；复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。位于胞质或胞核内棕黄色或黄褐色颗粒为阳性表达。阳性细胞计数：在400倍光学显微镜下每张切片采用盲法随机选取5个视野，分别计数免疫反应阳性细胞数，取平均值。

1.7 RT-PCR法检测脑组织TNF-α mRNA和ET-1 mRNA 提取脑组织总RNA。取细胞总RNA2 μl，加双蒸水2 ml，于分光光度计260 nm和280 nm处测吸光度(A)，A260/A280在1.9～2.1范围之间方可使用。选用β-actin基因作内参照，按照2-△△Ct相对定量公式计算TNF-α mRNA和ET-1 mRNA的含量。各引物序列、产物长度：β-actin正义：5′-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3′，反义：5′-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3′，产物长度155 bp；TNF-α正义：5′-GATCGGTCCCAACAAGGAGG-3′，反义：5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′，产物长度138 bp；ET-1正义：5′-TCCAAGAAAGGAAAACCC-3′，反义：5′-TGCAACACGAAAAGATGC-3′，产物长度126 bp。反应条件：β-actin：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，72℃ 50 s，35个循环；TNF-α：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，70℃ 50 s，34个循环；ET-1：94℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 52 s，40个循环。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件行单因素方差分析、最小显著差法(LSD-t)及秩和检验。

2 结 果

2.1 脑组织含水量 模型组与假手术组比较各时间点大鼠脑组织含水量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，药物组大鼠各时间点脑组织含水量降低(P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组脑组织含水量降低(P<0.05)；与1 d组比较，尼莫地平7 d组和扎里奴思方7 d组脑组织含水量均降低(P<0.05，P<0.01)；与3 d组比较，扎里奴思方7 d组脑组织含水量降低(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠缺血侧海马区TNF-α、ET-1的表达 模型组各时间点TNF-α、ET-1阳性细胞表达较假手术组显著升高(P<0.05,P<0.01)；与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方组TNF-α、ET-1阳性细胞表达显著降低(P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组TNF-α、ET-1阳性细胞表达降低(P<0.05)，差异有统计学意义。见图1，图2，表2。

2.3 对脑缺血再灌注大鼠脑组织TNF-α、ET-1 mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组各时间点TNF-α、ET-1 mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方组TNF-α、ET-1 mRNA表达显著降低(P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组TNF-α、ET-1 mRNA 表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。同组别不同时间点比较，尼莫地平7 d组TNF-α、ET-1 mRNA表达较1 d组降低(P<0.05)，扎里奴思方7d组TNF-α、ET-1 mRNA表达较1 d组降低(P<0.05)，差异均有统计学意义。见表3。

组别1d3d7d假手术组56.05±2.6256.05±2.6256.05±2.62模型组59.45±1.861)60.52±1.151)62.34±0.961)尼莫地平组57.68±1.032)58.72±1.022)57.84±0.7444)扎里奴思方组57.23±0.912)56.52±1.262)55.23±0.8143)5)6)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与尼莫地平组比较：3)P<0.05；与1 d组比较：4)P<0.05，5)P<0.01；与3 d组比较：6)P<0.05；下表同

图1 各组大鼠脑缺血再灌注后海马区TNF-α、ET-1阳性细胞变化(DAB，×400)

图2 各组大鼠脑缺血再灌注后海马区ET-1阳性细胞变化(DAB，×400)

组别TNF-α阳性细胞1d3d7dET-1阳性细胞1d3d7d假手术组5.18±0.945.24±0.895.47±1.126.58±2.526.45±2.236.72±1.71模型组30.35±1.541)32.74±0.691)38.81±1.671)22.79±7.351)23.14±6.261)24.65±5.041)尼莫地平组23.35±1.032)24.57±0.682)23.94±0.532)17.64±3.912)18.50±4.822)16.52±3.902)扎里奴思方组23.52±0.932)24.06±0.802)22.88±0.632)3)16.89±6.562)17.23±2.602)15.37±3.522)3)

组别TNF-α1d3d7dET-11d3d7d假手术组0.93±0.600.96±0.650.94±0.240.66±0.060.64±0.050.60±0.02模型组2.21±0.131)2.24±0.251)2.16±0.261)2.47±0.081)2.35±0.051)2.52±0.031)尼莫地平组1.79±0.132)1.63±0.042)1.54±0.102)5)1.88±0.132)5)1.93±0.042)1.65±0.102)扎里奴思方组1.64±0.082)3)1.53±0.092)3)1.24±0.302)3)4)5)1.82±0.142)3)1.76±0.132)3)1.51±0.122)3)4)5)

3 讨 论

回族医学对脑病的防治有着特有的理论认识和丰富的治疗经验〔8〕。《回回药方》论扎里奴思方“可开窍，净其浑身厚浊风痰，治疗痰盛弱病”，具有芳香开窍、化痰祛瘀、补肾益髓之功，是回族医学治疗缺血性脑病的常用方剂之一〔9〕。脑缺血损伤可引起一系列的级联反应，其中，炎症反应是造成缺血再灌注损伤的重要病理机制〔10〕。TNF-α表达增高可加快细胞凋亡〔11〕。TNF-α可上调血管内皮细胞和白细胞上的黏附分子的表达，加剧脑内炎症反应中性粒细胞与内皮细胞之间的黏附作用，阻碍脑组织的供血，损伤局部血管，导致血管通透性增加，促使脑缺血和水肿的发生，加重缺血性脑组织的损伤〔12〕。因此，下调炎性因子、阻止炎症联级反应，对神经细胞具有一定的保护作用〔13〕。ET-1可通过收缩血管，刺激血小板黏附和自由基释放，使血流量减少，加重脑梗死及周围组织的缺血、缺氧，促使脑组织和血管内皮细胞变性坏死〔14〕。缺血性损伤不仅造成血管内皮细胞的损害，刺激内皮细胞合成释放ET-1，而且缺血区神经组织也可因缺氧、软化和坏死刺激神经元或神经胶质细胞产生ET-1〔15〕。所以，阻断ET-1的产生和释放可减轻脑组织损伤，改善神经行为学功能。本实验结果显示，扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑神经元的保护作用可能是通过抑制脑内TNF-α和ET-1的表达有关。

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13 周天梅，佟丽妍，张卫华.续命汤对局灶性脑缺血中风大鼠血清白介素-1β和肿瘤坏死因子-α含量的影响〔J〕.中国中医急症，2014；23(2)：246-53.

14 Dreier JP，Kleeber J，Priller J，etal.Endothelin-1 potently induces leaos corticl spreading depression in vivo in the rat：model for an endothelial trigger of migrainous aura〔J〕.Brain，2002；125(1)：102-12.

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〔2016-05-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

Effect of Hui medicine Zhali Nusi Fang on expression of TNF-α and ET-1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats with cerebral ischemia-reperfusion

LIU Chao, LIU Jing-Xia, HEI Chang-Chun,etal.

Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the effect of Hui medicine Zhali Nusi Fang on expression of TNF-α and ET-1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods 60 male SD rats were randomly divided into: sham, model, nimodipine and Zhalinusi Fang groups (n=15). Except sham group, the other groups were fed with high fat-diet for 4 weeks. Then, rat stools were administered intragastrically once a day for three days to make the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome, then focal cerebral ischemia models were established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread. Rats were given with nimodipine (10.8 mg/kg), Zhali Nusi Fang (1.54 g/0.1 kg) by i.g. before the model preparation. Brain were taken at 1, 3, 7 days respectively to determine the brain water content, and then the expression of TNF-α and ET-1 was detected by immunohistochemistry and RT-PCR. Results Compared with sham group, brain water content of model group rats were increased(P<0.01), TNF-α and ET-1 positive cells and the expressions of TNF-α and ET-1 mRNA were up-regulated (P<0.01).Compared with model group, brain water content of Zhali Nusi Fang and nimodipine groups were reduced, TNF-α and ET-1 positive cells and the expressions of TNF-α and ET-1 mRNA were decreased (P<0.01). Compared with nimodipine group, TNF-α and ET-1 positive cells and the expressions of TNF-α and ET-1 mRNA of Zhali Nusi Fang 7 d group were decreased (P<0.05). Conclusions Zhali Nusi Fang has protective effects against the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion, which may be related with inhibiting the expression of TNF-α and ET-1.

Zhali Nusi fang; Cerebral ischemia-reperfusion; Heat-phlegm and sthenic-fu syndrome; Tumor necrosis factor-α; Endothelin-1

国家十二五科技支撑项目(SQ2013SF12E02181)；国家自然科学基金(81260569)

刘敬霞(1970-)，女，博士，博士后，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事中医药防治老年病研究。

刘 超(1991-)，男，在读硕士，主要从事中医药防治老年病研究。

R28

A

1005-9202(2017)06-1301-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.001