三阴性乳腺癌患者表皮生长因子受体-3的表达与肝转移的相关性及意义

黄少江

（第三军医大学新桥医院 肿瘤科，重庆 400037）

三阴性乳腺癌患者表皮生长因子受体-3的表达与肝转移的相关性及意义

黄少江

（第三军医大学新桥医院 肿瘤科，重庆 400037）

目的 探讨三阴性乳腺癌（TNBC）组织中表皮生长因子受体-3（HER-3）的表达情况，以及与肝转移的相关性和临床意义。方法 收集TNBC患者术后组织标本及临床资料，不同的表达水平的HER-3采用免疫组化法和蛋白质印迹法（Western blot）法检测，分析HER-3与临床病理特征及肝转移的相关性，其预后采用生存分析法（Kaplan-Meier）分析。结果 TNBC组织中HER-3的检测阳性率为72.63%（69/95），阳性表达与TNM分期及淋巴结转移相关，且肝转移发生率高于阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TNBC组织中HER-3阴性与HER-3阳性组患者中位无病生存期（DFS）分别为18.4和14.5个月，中位总生存期（OS）分别为31.2和26.3个月，差异均有统计学意义。结论 HER-3在TNBC组织中过度表达，与淋巴结及肝脏转移相关，是不良预后的重要因素，可作为TNBC预后评估非常有潜力的生物学标志物。

表皮生长因子受体-3；三阴乳腺癌；肝转移

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中预后最差的类型。固体恶性肿瘤的生长和进展的先决条件是肿瘤相关血管的生成，表皮生长因子受体是调节许多肿瘤血管生成的主要治疗靶点[1]。国内外学者一致认为筛选特异性靶标，开拓治疗新方案，实现早期诊断，是当前胃癌研究的重点方向。血管生成是肿瘤生长和转移的基础，表皮生长因子受体属于酪氨酸激酶家族，在细胞增殖、凋亡、血管生成和转移中起重要作用。表皮生长因子受体-3（epithelial growth factor receptor-3,HER-3/ErbB-3）近年来成为肿瘤的研究热点[2]，但HER-3是否与TNBC肝转移相关鲜见相关文献报道。本研究通过分析HER-3蛋白在TNBC组织中表达情况，分析与临床病理特征及肝转移性的相关性，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年7月-2012年12月于在第三军医大学新桥医院确诊的TNBC 95例女性乳腺癌术后患者。年龄39～69岁，平均56岁；病理分级Ⅰ期10例，Ⅱ期48例，Ⅲ期37例；淋巴结转移54例。乳腺癌经2位病理学专家诊断确定，其诊断和分级参照2010年WHO诊断标准。免疫组化标本经福尔马林固定及石蜡包埋；蛋白质印迹法（Western blot）检测新鲜组织置入-80℃冰箱冷冻保存备用。从术后第1天开始进行随访≥3年，主要采用电话、门诊等方式。

1.2 主要试剂及方法

①由Abcam公司（英国）购进兔抗人ErbB-3单克隆抗体及免疫组织化学（streptavidin-perosidase，SP）法试剂盒。免疫组织化学技术采用三步法，标本经甲醛固定，烘干脱蜡水化，3%过氧化氢H2O2室温孵育15 min，高压修复1.5 min，加入一抗（浓度1∶100）4℃过夜。加入二抗及链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法各室温孵育20 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色、苏木精染色、封片镜检。②Western blot法：裂解组织制作样品，煮沸4 min后取每个样品总量25 μl，行电泳转膜，加ErbB-3和β-肌动蛋白（β-action）抗体的封闭过夜。然后洗膜加二抗孵育洗膜显影。

1.3 结果判断

在显微镜下随机选取5个高倍镜视野，根据染色程度和阳性染色细胞所占百分取其平均数为最后得分。（-）与（±/+）定义为阴性，（++）与（+++）定义为阳性。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，计数资料比较用χ2检验，生存分析用生存分析法（Kaplan-Meier）法及Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HER-3在TNBC组织中的表达

免疫组织化学结果显示，HER-3阳性率为72.63%（69/95），主要表达于细胞质，极少部分表达于细胞核；HER-3（-）为11.58%（11/95），HER-3（±/+）为15.79%（15/95），HER-3（++）为33.68%（32/95），HER-3（+++）为38.95%（37/95）。见图1。

2.2 HER-3与临床病理参数的关系

HER-3的阳性表达与乳腺癌患者年龄、核分级、P53及肿瘤大小无相关性（P＞0.05），HER-3的阳性表达与分期、淋巴结状况存在相关性（P＜0.05）。见表1。

表1 HER-3与临床病理参数的关系

2.3 HER-3蛋白在TNBC中的表达

应用兔抗人HER-3单克隆抗体对TNBC癌旁组织和癌组织测及灰度测定和分析，特异性染色条带出现在约185kD处，证实HER-3的表达量与病理分期相关（见图2）。组间两两比较差异有统计学意义（P=0.000），在癌旁组织中HER-3蛋白表达量最低，分期越晚表达量越高，各组比较差异有统计学意义（P=0.000）。见表2。

表2 HER-3蛋白在TNBC中的表达

图2 HER-3蛋白在TNBC中的表达

2.4 HER-3表达与TNBC肝转移的相关性

随访期间38例患者出现肝转移，HER-3表达分为阴性（-和±/+）肝转移发生率低于阳性（++、+++）组，差异有统计学意义（P=0.018），见表3。

表3 HER-3表达与肝脏转移的相关性

2.5 HER-3不同表达对TNBC预后的影响

TNBC组织中HER-3阴性与HER-3阳性中位DFS分别为：18.4和14.5个月，差异有统计学意义（P= 0.000）。HER-3阴性与阳性中位OS分别为31.2和26.3个月，差异有统计学意义（P=0.000）。见图3。

图3 HER-3阴性及阳性对乳腺癌DFS（左）和OS（右）的影响

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，尽管随着手术水平的提高，放化疗、内分泌治疗及靶向治疗的应用，乳腺癌的生存期得到明显的提高。但三阴乳腺癌由于其异质性，预后仍非常差[3]。对乳腺癌的发生、浸润和转移的机制尚不完全清楚，可能包括自身基因的异常表达、肿瘤血管的异常增生、免疫功能低下及炎症因子的持续存在等多种因素。早期乳腺癌淋巴结转移的相关因素对预后起着至关重要的作用，不仅是临床病理学改变，也包括分子生物学标志物的异常改变。探索一种可靠的生物标志物，将有助于乳腺癌早期诊断及改善治疗方案，并预测患者的预后。鉴于在乳腺癌细胞增殖发生至关重要的作用，细胞增殖的生物标志物是潜在的评估TNBC风险的重要工具。

人类表皮生长因子受体家族蛋白过度表达与肿瘤的恶性程度有关，其家族主要成员为HER-1或EGFR、HER-2、HER-3和HER-4，这4个基因可与受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）膜结合形成一个复杂的信号转导网络。该受体有着相似的结构，包括胞外配体结合域，一个跨膜结构域，细胞内酪氨酸激酶结构域和胞质尾区。受体功能的特征在于均相/异源响应于配体结合，激酶结构域活化，C末端酪氨酸残基自磷酸化，并对接蛋白质以引发下游信号的酪氨酸磷酸化。该受体存在多个特性，包括配体和受体表达的特定细胞型态，配体和受体的亚细胞分离，并且细胞内受体结合蛋白，多样性的放大或衰减HER家族信号传导的控制。HER家族中研究最多的因子是VEGF和HER-2，但近来有学者提出HER-3可能成为癌症生物学中研究的一个新目标[4]。但不少研究者认为，单靶点的治疗可能导致耐药，能多靶点作用于HER家族的是未来靶向治疗的新目标。与其他家庭成员一样HER-3受体可以启动信号转导，可能受体过度表达可导致促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞活力和促进血管生成和转移形成[5]。由于其激酶活性缺失，HER-3不能在二聚体激活信号；然而HER-3配体的存在，可以促进EGFR和HER-2激酶的活性，从而诱导C末端磷酸化，磷酸化酪氨酸残基的结合，招募Src同源结构域（Src homology domain，SH2）结构域的蛋白以及多聚嘧啶序列结合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）结合蛋白，最终导致下游信号通路的激活[6]，因此阻断HER-3抗体，可以提高抗肿瘤作用。HER-3衔接蛋白SHCA，以及增强TGF-β诱导 HER-2介导的磷脂酰肌醇 -3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）激活，并涉及与Rac1蛋白、Pak1的细胞表面整合和肌动蛋白细胞骨架共定位在细胞膜突起的前缘导致细胞迁移。在许多肿瘤中看来，HER-3作为RTK和PI3K激活之间的主要环节，其最近为选择性抑制PI3K信号途径RTK驱动肿瘤得到重视。由于HER-3配体的存在，可以促进EGFR和HER-2激酶的活性，从而诱导的HER-3的C末端磷酸化。通过诱导EGFR和HER-2激酶抑制剂，阻断HER-3抗体，可以提高抗肿瘤作用。但如何阻断HER-3的活性以及EGFR和HER-2通路，成为目前的研究难题。

HER-3表达与胃癌进展参数显著相关，包括肿瘤浸润深度、淋巴结、远处转移、肿瘤分期和疾病复发，其阳性表达有着较差的生存，它可能成为一个新靶向治疗的目标[7]。KA DAMASCENO等[8]在动物模型的胃癌中发现HER-3≤90%阳性表达，如何利用这些高表达因子来为人类恶性肿瘤的治疗奠定基础是目前关注的热点。H STYCZEN等[9]在结直肠癌肝转移患者中发现HER-2的过表达仅8%，而HER-3 有75%出现过表达，他们认为HER-3的靶向治疗可能在未来会超越HER-2和EGFR，但前期仍然需要大量的基础研究和临床数据[10]。SY BAE等[11]发现，HER-3过度表达是三阴乳腺癌患者不良预后的重要指标，可能是HER-2和EGFR阴性的患者使用靶向药另一个方向；然而一些研究者发现，HER-3的表达与乳腺癌的预后没有直接相关性[12]，因此HER-3在乳腺癌中的作用以及与肝转移的相关性还有待验证。

本研究发现，HER-3在TNBC组织中过度表达，其阳性表达与TNM分期、淋巴结状况以及肝转移发生率相关。无论中位DFS还是OS阳性组均低于阴性组，这与一些学者的研究基本一致[13]。本研究发现，HER-3阳性表达的TNBC患者更容易发生肝转移，是不良预后的危险因素，其具体的作用机制需要进一步的研究证实。综上所述，HER-3在TNBC组织中过度表达，与淋巴结及肝脏转移相关，是不良预后的重要因素，可作为TNBC预后评估非常有潜力的生物学标志物。

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Significance of HER-3 in predicting liver metastasis in three negative breast cancer patient

Shao-jiang Huang
(Department of oncology,the Third Military Medical University Xinqiao Hospital, Chongqing 400037,China)

Objective To investigate the expression of HER-3 in TNBC tissues,and to explore the relationship and clinical value with liver metastasis.Methods TNBC tissue specimens and clinical data were collected,and the expression of HER-3 was detected by immunohistochemical and Western blot method.Clinicopathological features and correlation with liver metastasis were analyzed,and the prognosis was analyzed by Kaplan Meier survival analysis.Results The positive rate of HER-3 in TNBC was 72.63% (69/95),and had correlation with TNM stage and lymph node status but not related to nuclear grade,p53 or tumor size.The incidence of liver metastasis in HER-3 positive group was significantly higher than the negative group statistically.The median DFS of HER-3 negative and positive group were 18.4 and 14.5 months,and the median OS was 31.2 and 26.3 months with statistically significant.Conclusions The HER-3 expresses in TNBC,and promotes the invasion of cancer cells,and is closely related to liver metastasis,and can be used as a potential biomarker for assessing the prognosis of TNBC.

HER-3;triple-negative breast cancer;liver metastasis

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.007

1005-8982（2017）05-0033-05

2016-08-08